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.2009年2月；23(2):513-22.
doi:10.1096/fj.07-098269。 Epub 2008年10月23日。

Robo1和Robo4通过WASP和其他肌动蛋白促核因子积极参与丝状伪足形成和内皮细胞运动

海伦·谢尔顿 1, 莫德·安德烈, 约翰·A·莱格, 保罗·希尔, 约翰·M·赫伯特, 理查德·塞森, 安舒拉·S·夏尔马, Jan K Kitajewski先生, 维多利亚L希思, 罗伊·比克内尔
附属公司

Robo1和Robo4通过WASP和其他肌动蛋白促核因子积极参与丝状伪足形成和内皮细胞运动

海伦·谢尔顿等。 美国财务会计准则委员会J. 2009年2月.

摘要

本研究旨在进一步阐明Roundabout蛋白在内皮细胞中的功能。我们发现，Robo1和Robo4都存在于人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，并使用小干扰RNA（siRNA）技术抑制了其表达。然后在各种体外试验中研究了Roundabout敲除内皮细胞。我们还使用Robo4的胞内结构域作为诱饵进行了酵母2杂交分析，以确定相互作用的蛋白质和下游信号。Robo1和Robo4 siRNA敲除和转染Robo4绿色荧光蛋白均抑制内皮细胞运动并破坏Matrigel上的管形成。酵母2-杂交和谷胱甘肽-S-转移酶下拉分析显示Robo4与Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASP）、神经Wiskott-Aldrich综合症蛋白和WASP相互作用蛋白肌动蛋白核复合体结合，这与调节细胞运动的作用一致。我们进一步证明，Robo1与Robo4形成异二聚体复合物，并且将Robo4GFP转染到HUVEC中可诱导丝状伪足形成。最后，我们使用Robo1敲除细胞证明Robo1对Robo4介导的丝状体诱导至关重要。我们的结果支持这样一个模型，即Slit2与Robo1/Robo4异二聚体结合，激活肌动蛋白核保护因子，促进内皮细胞迁移。

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数字

图1
图1
Robo4 siRNA抑制伤口愈合和Matrigel管形成。A类)不同时间点HUVEC中1 nM R4（1）siRNA的免疫印迹。B类)1 nM Robo4 siRNA寡核苷酸转染后Robo4和ISG20 mRNA水平的qPCR分析。结果归一化为flotilin2负荷控制。C类)用Robo4 siRNA-转染的HUVEC进行伤口愈合试验。D类)相对于模拟控制，测量每个伤口覆盖的距离***P（P）< 0.001与。加扰控制。E类)与Robo4 siRNA-转染HUVEC的Matrigel。比例尺=200μm。F类)测量不同条件下Matrigel分析中出现的平均节点数***P（P）< 0.001与。模拟控件。误差条±标准偏差.M，模拟转染；S、 加扰负控制双工；R4（1），Robo4双链1 siRNA；R4（2），Robo4双链2 siRNA。
图2
图2
Robo4-GFP在HUVEC中诱导丝状伪足形成。A类)FL-Rob4-GFP和GFP单独在HUVEC中表达，并用TRITC卵磷脂染色。箭头表示丝状伪足。比例尺=10μm。B类)用识别Robo4（MR7）胞外结构域的单克隆抗体进行FACS扫描。绿色，MR7；蓝色，同型IgG2a阴性对照。C类)单独表达GFP或FL-Robo4-GFP后丝状伪足数量的定量分析(***P（P）<0.001). 误差线±东南方。
图3
图3
WASP和NWASP用HUVEC表示。A类)全长Robo4、Robo4酵母2杂交诱饵和细胞内Robo4-HA-GST构建物的结构域。免疫球蛋白样结构域；Fn3，纤维连接蛋白3型结构域；Tm，跨膜结构域；CC0/2，细胞质保守结构域0和2。B类)WASP和NWASP在各种细胞系和HUVEC中表达的免疫印迹分析。
图4
图4
Robo4在GST下拉分析中绑定WASP、NWASP和Mena。A类)HA-GST单独免疫印迹和FL-WASP-HA-GST下拉框与全长Robo4-myc和WIP-myc阳性对照。B类)单独的HA-GST和Int-Robo4-HA-GST下拉免疫印迹与NWASP-myc、WASP-GFP和Mena-myc阳性对照。
图5
图5
Robo1 siRNA抑制在体外血管生成。A类)一组裂解物中Robo4和Robo1蛋白表达的免疫印迹分析。B类)Robo1-Robo4结合的协同免疫沉淀分析。C类)滴定分析确定最大Robo1击倒所需的siRNA双工体[R1（1）和R1（2）]的最佳浓度。D类)用R1（1）和R1（2）siRNA-转染的HUVEC进行Matrigel分析。比例尺=200μm。E类)测量不同条件下Matrigel分析中出现的节点数**P（P）<0.05与模拟控件。误差线±标准偏差。
图6
图6
Robo1和Robo4合作形成丝状伪足。A类)定量模拟转染或Robo1 siRNA-处理的仅表达GFP或FL-Robo4-GFP的HUVEC中的丝状体数量。B类)改良Boyden小室分析法分析HUVEC向不同刺激的迁移***P（P）< 0.001. 误差线±东南方。
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