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.2008年11月；36(20):6439-49.
doi:10.1093/nar/gkn693。 Epub 2008年10月8日。

荧光相关光谱和荧光互相关光谱揭示了人体细胞体内负载核RISC的细胞质起源

托马斯·奥特 1, 约格·穆策, 沃尔夫冈·斯塔罗斯克, 拉斯·温曼, 朱莉娅·霍克, 卡林·克里尔, 冈特·梅斯特, 佩特拉·施维利
附属机构

荧光相关光谱和荧光互相关光谱揭示了人体细胞体内负载核RISC的细胞质起源

托马斯·奥特等。 核酸研究. 2008年11月.

摘要

对RNA干扰（RNAi）的研究提供了证据，证明除了特性良好的细胞质机制外，核机制也存在。核RNA-induced silenting complex（RISC）在哺乳动物细胞中形成的机制以及核质室中RNA沉默途径之间的关系尚不清楚。在这里，我们通过在体内应用荧光相关和互相关光谱学（FCS/FCCS）表明，存在两种不同的RISC：细胞质中一个大约3 MDa的大复合体和细胞核中一个约158 kDa的20倍小复合体。我们进一步表明，核RISC仅由Ago2和短RNA组成，装载在细胞质中并导入细胞核。根据miRNA-like相互作用和同源RNA切割受损，负载的RISC根据靶点的存在在细胞核中积累。总之，这些结果表明，RISC在细胞核和细胞质之间穿梭的新机制确保了两个小室中小RNA的伴随基因调控。

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图1。
图1。
核RISC不同于细胞质RISC。(A类)10G细胞细胞核（黑线虚线）和细胞质（黑线）中EGFP-Ago2的标准FCS曲线。该图显示了自相关函数G公司（τ） 滞后时间τ（有关FCS和自相关函数的更多详细信息，请参见补充资料). 曲线是至少10个测量值的平均值。作为对照，仅在ER293细胞中记录EGFP的FCS曲线（细胞核：绿色虚线，细胞质：绿色线）。(B类)10G细胞核和细胞质提取物的EGFP-Ago2蛋白印迹。为了显示细胞核和细胞质部分的纯度，用α-细胞周期蛋白T1和α-GAPDH抗体进行了蛋白质印迹分析。(C类)在允许分离含有不同hAgo2的mRNP的条件下，通过蔗糖密度离心分离HEK 293细胞质和核提取物，并用特异性α-hAgo2抗体进行western blot分析。
图2。
图2。
非对称导向链并入细胞核和细胞质RISC。(A类)siRNA siTk3的序列和自由能图示。为了遵循单个股的合并，双工器要么标记在导轨或乘客股的3′端。(B类)用指定量的siTK3或NegsiRNA以及固定浓度的pGL2-control和pRL-TK报告质粒转染ER293细胞。48小时后，靶向与对照荧光素酶浓度的比值标准化为深灰色的NegsiRNA对照；siTK3以灰色表示。绘制的数据来自三个不同实验的平均值±SD(C类)10G细胞微量注射后不同孵育时间细胞质中EGFP-Ago2和siTK3标记副链的归一化互相关曲线体内（顶部）。曲线是至少10个测量值的平均值。在底部的图表中显示了细胞质（填充框）和细胞核（开圈）中产生的互相关振幅。(D类)细胞质中标记的siTK3引导链的标准化互相关曲线（顶部）。下图描绘了细胞质（填充框）和细胞核（开放圆圈）中不同孵育时间的相互关系，如漫画所示。数据表示为平均值±SEM。
图3。
图3。
nRISC负载水平受靶RNA相互作用的影响。(A类)不同孵育时间核靶向siRNA 7SK1的细胞质（填充框）和细胞核（开放圈）中的交叉相关振幅。通过标记导向股（蓝色）或副股（灰色）并在至少10个细胞中进行测量来获得数值。说明了siRNA的序列和自由能。(B类)核靶向siRNA 7SK1的交叉相关实验，如（A）所示，图示为细胞核中的交叉相关与细胞质中的交叉关联的比率。此外，还绘制了其他测试siRNA的比率。(C类)siRNA 7SK1核聚积的靶向特异性。绘制了NegsiRNA、siRNA 7SK2和7SK3转染后（48小时）7SK1和7SK1孵育3小时后细胞核与细胞质的互相关比率。此外，还描述了si7SK2和siTK3的比率，以进行比较。(D类)用于分析靶相互作用影响的所用7SK siRNA的靶位点示意图。(E类)定量PCR（qPCR）分析不同指示siRNA双链的7SK snRNA敲除。(F类)siRNAs 7SK1、7SK3-突起、7SK3、7SK2和GAPDH孵育3小时后细胞质（填充条）和细胞核（开放条）中的交叉相关振幅。平均值±SEM。
图4。
图4。
裂解受损的RISC靶相互作用介导RISC在细胞核中的积聚。(A类)对实验的大纲进行了说明。EGFP-Ago2作为RISC的荧光标记，可以与Cy5标记的靶RNA相互作用。与靶RNA的相互作用由FCCS决定体内. (B类)靶向RNA微注射10G细胞的LSM图像（绿色：EGFP-Ago2，红色：靶向RNA，右侧面板：叠加）。比例尺指示10μm。(C类)微注射后1或3小时进行交叉相关测量。数据表示为平均值±SEM，填充条表示细胞质中的测量值，开放条表示细胞核中的测量结果。(D类)用指定数量的NegsiRNA、siTK3和siTK3-B2以及固定浓度的pGL2-Control和pRL-TK报告质粒转染ER293细胞。48小时后，靶标与对照荧光素酶浓度的比值标准化为NegsiRNA对照（黑色）；siTK3-B2（灰色）和siTK3（白色）。绘制的数据是三个不同实验±SD的平均值。
图5。
图5。
核激活的RISC来源于细胞质。对7SK1引导链并入RISC进行了细胞质微量注射、细胞质注射和小麦胚芽凝集素（WGA）抑制通过核孔的主动转运以及7SK1和WGA的核注射。孵育3小时后，采集LSM图像（红色：Cy5，绿色：EGFP，黄色：叠加）和互相关测量。比例尺显示10μm，数据表示为平均值±SEM；填充条表示细胞质中的测量值，开放条表示细胞核中的测量值。
图6。
图6。
人类RISC负载和在细胞质和细胞核之间穿梭的模型。（i） 非对称导向-标记掺入仅局限于细胞质，（ii）导向-标记介导的细胞质靶点识别，（iii）完美匹配导致RISC介导的靶点降解，（iv）一部分细胞质负载的RISC导入细胞核，以确保全细胞靶点调节。细胞质共因子与hAgo2蛋白解离，从而形成nRISC，（v）引导链介导的细胞核中的靶识别。完美的RISC靶向相互作用导致自由的RISC可以输出到细胞质中，（vi）而miRNA-like相互作用导致RISC在细胞核中积累，从而在细胞核中进行有效调节。
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