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.2008年10月1日；68(19):7819-27.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-1357。

SLITs通过沉默乳腺上皮内的Sdf1/Cxcr4抑制体内肿瘤生长

丽贝卡·马洛 1, 菲利斯·斯特里克兰, 李继新（Ji Shin Lee）, 吴新燕, 米拉娜·佩贝尼托, 米哈伊尔·宾纽伊斯, 伊丽莎白·K·勒, 安吉尔·莫兰, 赫克托·马西亚斯, 罗伯特·卡迪夫, 萨拉斯瓦提·苏库马尔, 林赛·辛克
附属公司

SLITs通过沉默乳腺上皮内的Sdf1/Cxcr4抑制体内肿瘤生长

丽贝卡·马洛等。 癌症研究. .

勘误表in

  • 癌症研究，2010年5月1日；70(9):3853

摘要

编码缝隙及其Robo受体的基因在包括乳腺癌在内的多种癌症中都被沉默，这表明该信号通路在抑制肿瘤发生中起着作用。这些抑瘤作用的分子机制尚未阐明。这里，我们表明，小鼠乳腺或人类乳腺癌细胞中缝隙或其Robo1受体的缺失导致Sdf1和Cxcr4信号轴的协同上调，特别是在乳腺上皮内。伴随着细胞增生性改变和周围基质的促结缔组织增生性改变。在人类乳腺肿瘤组织中，Slit和Cxcr4表达之间也存在类似的负相关。此外，我们在异种移植物模型中表明，Slit过表达下调CXCR4并主要抑制肿瘤生长。这些研究将Slits归类为Sdf1和Cxcr4的负调控因子，并确定乳腺增生病变中的一个分子特征，这表明关键促转移基因的上调不适当。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露

没有披露潜在的利益冲突。

数字

图1
图1
损失狭缝2和狭缝3乳腺上皮的表达导致增生性紊乱病变的形成。A类，上皮中缺少SLIT导致损伤形成。通过+/+和狭缝2−/−;狭缝3−/−乳房突起。箭头，导管肌上皮细胞层；箭头CK14阳性细胞异常位于管腔内。红色条，致密促结缔组织增生基质。L（左），流明。B类，缺乏SLIT导致增生。用虚线表示上皮/基质界面的典型病变。箭头，Ki67+细胞。柱，平均百分比[n个=3只12周龄的动物，15个视野/只（5×）]；酒吧，SD.***，P（P）<0.0001，未配对t吨测试。C类ROBO1缺乏导致三维培养中的表型紊乱。转染后，在Matrigel中培养MCF7细胞。5天后，拍下菌落照片（5×），并计算无组织结构的百分比。显示了具有代表性的菌落图像。比例尺，10µm。柱，平均百分比；酒吧，SD.***，P（P）<0.0001，方差分析。RNA干扰RNA干扰。D类ROBO1缺乏增加细胞增殖指数。柱，Ki67的平均百分比+细胞；酒吧，SD.**，P（P）<0.001，方差分析。
图2
图2
损失狭缝2和狭缝3导致小鼠乳腺和人MCF7细胞中CXCR4上调。A类，英寸狭缝2−/−;狭缝3−/−生长，CXCR4蛋白表达局限于上皮细胞，病变之间有结缔组织增生性基质。在+/+和狭缝2−/−;狭缝3−/−乳房突起。箭头，阳性上皮细胞。红色条，致密促结缔组织增生基质。比例尺，20微米。CXCR4免疫染色根据阳性率和染色强度进行评分，并绘制垂直散点图。红色条，平均得分。明显更多的CXCR4染色可见于狭缝2−/−;狭缝3−/−外生长。***，P（P）<0.0001，曼希特尼。B、 Cxcr4号机组mRNA特异性存在于狭缝2−/−;狭缝3−/−生长物。现场+/+和上的杂交狭缝2−/−;狭缝3−/−反义探针显示的副产物Cxcr4号机组mRNA输入狭缝2−/−;狭缝3−/−，但不是+/+单元格。箭头，阳性上皮细胞。感测探针显示很少或没有背景染色。比例尺，20微米。L（左），流明。C类，MCF7细胞中SLIT/ROBO信号的丢失导致Cxcr4号机组基因表达。用对照或机器人1siRNA，然后与pGL-CXCR4（−375）共转染，其中包含Cxcr4号机组启动子区耦合到F-荧光素酶基因和pRL-TK（R-荧光素酶）。36小时后裂解细胞，并测量荧光素酶活性三次。对转染效率的活性进行了标准化。柱平均相对荧光素酶活性；酒吧，东南部**，P（P）=0.0095，Mann-Whitney试验。D类MCF7细胞中SLIT/ROBO信号缺失导致CXCR4蛋白水平升高。代表性免疫印迹(n个= 4).数字，CXCR4波段强度。
图3
图3
损失狭缝人类肿瘤中的表达与Cxcr4.A公司使用Oncomine Cancer Profiling Database（32）绘制了Richardson微阵列数据集数据的方框图。狭缝2(P（P）=2.6E–10）和狭缝3(P（P）=7.1E–9）在肿瘤中的表达显著降低，而Cxcr4号机组(P（P）=1.8E–5）表达升高。正常，n个= 7; 肿瘤，n个=40；P（P）值来自t吨测试。B类，表达水平，通过定量PCR狭缝2，狭缝3、和Cxcr4号机组是从一组肿瘤中获得的，其数值根据内部控制标准化GAPDH公司.然后将数据归一化为从正常乳房获得的值(n个= 6). 值1等于平均正常乳房中该基因的表达水平。25个肿瘤样本中有17个（68%）显示肿瘤细胞升高Cxcr4号机组表达与正常乳房相比。在这些肿瘤中，这种升高对应于狭缝2或狭缝3.立柱平均相对表达；酒吧，东南。狭缝2与Cxcr4号机组: **,P（P）< 0.011;狭缝3与Cxcr4号机组: ***,P（P）<0.001，方差分析。C类，肿瘤中SLIT表达降低，而CXCR4水平升高。用抗SLIT2、抗SLIT3和抗CXCR4对正常乳腺、DCIS和IDC组织切片进行免疫染色。显示了具有代表性的图像。比例尺，100µm。D类，根据细胞阳性率和染色强度对免疫染色切片进行评分。分数绘制在垂直散点图上。黑色条，平均得分。两个SLIT2（*，P（P）=0.01，方差分析）和SLIT3（***，P（P）<0.0001，方差分析）显示，与正常乳腺相比，DCIS和IDC的表达降低。相反，CXCR4在正常乳腺中的表达水平很低，但在DCIS和IDC中表达增加（**，P（P）=0.0005，方差分析）。
图4
图4
损失狭缝表达导致SDF1的协同上调和促结缔组织增生基质的形成。A、 狭缝2−/−;狭缝3−/−而不是+/+，单元格响应SDF1的点源。从生长物中制备原代上皮细胞，并将其置于SDF1的稳定液体梯度中（29）。在0分钟和60分钟时采集相位对照图像。使用ImageJ，源象限中细胞面积的变化(箭头)已计算。柱，平均百分比变化(n个= 7);酒吧，东南*，P（P）=0.0018，曼希特尼。B类，SDF1蛋白存在于周围的基质中狭缝2−/−;狭缝3−/−发育不良。在+/+和狭缝2−/−;狭缝3−/−乳房突起。虚线上皮/基质界面。打开箭头间质阳性染色；箭头，上皮细胞表达SDF1。比例尺，20微米。SDF1免疫染色根据阳性率和强度进行评分。分数绘制在垂直散点图上。红色条，平均得分。SDF1染色明显增多狭缝2−/−;狭缝3−/−副生长。*，P（P）=0.018，曼希特尼。C类，SDF1吸引巨噬细胞。一，含有BSA和SDF1 Elvax颗粒的脂肪垫中F4/80染色的代表性图像。F4/80的数量+对颗粒周围的细胞进行计数，并表示为F4/80的数量+每微米电池数2.柱，平均值；酒吧，SD.*，P（P）=0.0086，未配对t吨测试。巨噬细胞包围狭缝2−/−;狭缝3−/−管道。b条，F4/80染色在+/+与狭缝2−/−;狭缝3−/−组织。测量管道长度和F4/80的数量+对细胞进行计数（ImageJ软件）。柱，平均值；酒吧，SD.***，P（P）<0.0001，未配对t吨测试(n个=3只动物，10个视野/动物）。基质周围狭缝2−/−;狭缝3−/−导管具有促结缔组织增生性。c（c），Masson三色染色+/+与狭缝2−/−;狭缝3−/−组织。红色条，基质宽度。对导管进行纵向成像，测量导管长度和阳性染色面积（ImageJ软件）。柱，平均值；酒吧，标准差***，P（P）<0.0001，未配对t吨测试。比例尺，20微米。D、 标准df1mRNA特异性地存在于细长基质细胞的亚群中(开放箭头)和上皮细胞(闭合箭头)英寸狭缝2−/−;狭缝3−/−发育不良。现场+/+和上的杂交狭缝2−/−;狭缝3−/−反义探针显示的副产物标准df1mRNA输入狭缝2−/−;狭缝3−/−，但不是+/+单元格。感测探针没有或几乎没有背景染色。比例尺，20微米。
图5
图5
CXCR4和SDF1的协同上调是由于乳腺上皮内缺乏SLIT/ROBO1信号。A类，检查机器人1基因表达，我们利用了lacZ公司内源性控制基因机器人1启动子在−/−组织中。一，纵截面机器人1−/−导管β-半乳糖苷酶活性染色。b条用抗ROBO1抗体对+/+导管纵切面进行免疫染色。打开的箭头基质染色阳性；箭头，阳性上皮细胞。比例尺，20微米。L（左），流明。B类，移植机器人1−/−乳腺外生长显示严重的导管缺陷，与狭缝2−/−;狭缝3−/−发育不良。比例尺，20微米。C类，CXCR4蛋白在机器人1−/−发育不良。用抗CXCR4对+/+基质/+/+上皮和+/+基质进行代表性免疫染色/机器人1−/−上皮细胞。箭头，阳性细胞。比例尺，20微米。对CXCR4免疫染色进行评分并绘制在垂直散点图上。红色条，平均得分。明显更多的CXCR4染色可见于机器人1−/−外生长。***，P（P）<0.0001，Mann-Whitney试验。D类，SDF1存在于周围的基质中机器人1−/−上皮外生长(一;开放箭头)在上皮细胞亚群中(箭头). 用抗SDF1对+/+基质/+/+上皮和+/+基质进行代表性免疫染色/机器人1−/−上皮细胞。对SDF1免疫染色进行评分并绘制垂直散点图。红色条，平均得分。SDF1染色明显增多机器人1−/−外生长。***，P（P）<0.0001，Mann-Whitney试验。标准df1基质成纤维细胞亚群中存在信使核糖核酸(b条;开放箭头)和上皮细胞(箭头)英寸机器人1−/−发育不良。现场+/+基质/+/+上皮和+/+基质的杂交/机器人1−/−反义探针揭示上皮细胞生长标准df1+/+基质中的mRNA/机器人1−/−上皮细胞而非+/+基质/+/+上皮细胞。感测探针显示很少或没有背景染色。比例尺，20微米。
图6
图6
狭缝MDA-MB-231细胞中的表达通过减少CXCR4的表达来阻止肿瘤生长。A、 狭缝2-HA和狭缝3-与单纯载体对照系相比，Myc稳定细胞系表达低水平的CXCR4。稳定狭缝2-透明质酸(n个=3）和狭缝3-myc公司(n个=2）克隆选择产生细胞系。用抗CXCR4探针检测稳定细胞系提取物。柱，平均CXCR4波段强度(n个=每条线2）；酒吧，东南部**，P（P）<0.001，方差分析。B类，的表达式狭缝2或狭缝3导致肿瘤较小。肿瘤是使用狭缝并控制稳定的细胞系。n个=每行12只小鼠。积分，每天平均肿瘤体积；酒吧，SE。***，P（P）< 0.0001; **,P（P）< 0.001; *,P（P）<0.05，方差分析。显示了原位肿瘤的典型图像。比例尺0.25毫米。C类，肿瘤表达狭缝2或狭缝3与对照肿瘤相比，CXCR4蛋白的含量显著减少。柱，CXCR4免疫印迹条带平均强度n个=3个肿瘤；酒吧，东南部**，P（P）=0.01，方差分析。
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参考文献

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