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.2008年9月23日；105（38）：14447-52。
doi:10.1073/pnas.0803790105。 Epub 2008年9月15日。

线粒体脱乙酰酶Sirt3在调节能量平衡中的作用

冯贤安 1, Hyun-Seok Kim先生, 宋世伟, In Hye Lee公司, 刘杰, 瓦西里普洛斯Athanasios Vassilopoulos, Chu Xia Deng先生, 芬克尔
附属公司

线粒体脱乙酰酶Sirt3在调节能量平衡中的作用

冯贤安等。 美国国家科学院程序. .

摘要

在这里，我们证明了线粒体NAD依赖性脱乙酰酶Sirt3在维持基础ATP水平和调节线粒体电子传递中的作用。我们注意到Sirt3（-/-）小鼠胚胎成纤维细胞基础ATP水平降低。用野生型但不是脱乙酰酶缺陷型的Sirt3重组可以恢复这些细胞中的ATP水平。此外，在野生型小鼠中，ATP的静息水平与器官特异性Sirt3蛋白表达相关。值得注意的是，在缺乏Sirt3的小鼠中，心脏、肾脏和肝脏中ATP的基础水平降低了>50%。我们进一步证明，线粒体蛋白乙酰化在Sirt3（-/-）组织中显著升高。此外，在没有Sirt3的情况下，电子传输链复合物I的多个组分显示乙酰化增加。Sirt3还可以与复合物I的至少一个已知亚单位39-kDa蛋白NDUFA9进行物理相互作用。功能研究表明，来自Sirt3（-/-）动物的线粒体显示出对复合物I活性的选择性抑制。此外，外源性Sirt3与线粒体孵育可以增强复合物I的活性。这些结果表明蛋白质乙酰化是复合物I活性的重要调节器，并证明Sirt3在体内发挥调节和维持基础ATP水平的作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Sirt3调节基础ATP水平。(A类)五个独立的原代野生型MEFs分离株和相似数量的独立Sirt3的基础ATP水平−/−MEF细胞分离物。(B类)苏尔特3−/−用编码GFP的表达载体以及空载体、表位标记的野生型或脱乙酰酶不活性（HY）Sirt3转染MEF。转染后36小时，通过FACS和ATP检测对GFP阳性细胞进行分类。ATP水平相对于载体转染的Sirt3表达−/−细胞。所示为三个独立实验的平均值，每个实验重复三次。(C类)用空载体、表位标记野生型或Sirt3（HY）转染HeLa细胞，转染48小时后测定ATP水平。所示为四个独立实验的平均值±SD。(D类)野生型小鼠各组织器官中ATP的绝对水平(n个= 3; 平均值±SD）。图中显示了每个组织中相应的Sirt3表达水平以及70-kDa复合物II相关蛋白Fp（CII-Fp），作为线粒体数量和GAPDH蛋白质负荷的一般测量值。(E类)野生型（黑条）和Sirt3中ATP的标准化水平−/−已知Sirt3高表达的各种器官（心脏、肝脏和肾脏）以及内源性Sirt3低表达或无表达的器官（胰腺）中的小鼠（白条）(n个=每组4只动物）。*，P（P）< 0.01.
图2。
图2。
Sirt3调节线粒体蛋白乙酰化。(A类)使用两种年龄匹配野生型（+/+）或Sirt3的总肝线粒体蛋白提取物进行内部乙酰赖氨酸残基的Western blot（WB）分析−/−老鼠。线粒体蛋白VDAC1用作负荷控制，Sirt3的表达也显示出来。(B类)野生型与Sirt3中免疫捕获肝复合体I的乙酰化水平−/−鼠标。复合物I的亚单位9（NDUFA9）用作免疫捕获的负荷控制。(C类)免疫捕获复合物II的类似乙酰化分析。复合物II（C II-Fp）的70-kDa Fp亚基用作负荷控制。(D类)Sirt3脱乙酰复合物I在体外从烟酰胺处理的HeLa细胞中分离出复合物I并培养2小时在体外仅使用脱乙酰酶反应缓冲液（−）或含有纯化Sirt3或Sirt4的反应缓冲液。复合物I蛋白NDUFA9的水平与外源添加的标记Sirt3和Sirt4的水平一样，显示为负载控制。(E类)的级别体内转染空载体（V）、野生型Sirt3（WT）或脱乙酰酶非活性形式Sirt3的HeLa细胞中的复合物I乙酰化。免疫沉淀；MW，分子质量。
图3。
图3。
Sirt3与ETC的复合体I相关联(A类)Sirt3与复合物I结合。使用等量的HeLa细胞裂解液免疫捕获复合物I或复合物II。然后在SDS/PAGE上解析这些ETC成分，并探索其与Sirt3的关联。人Sirt3的短型和长型都与复合物I相关。通过探测复合物I组分NDUFA9和复合物II的70kDa-Fp亚基的剥离印迹，证明了免疫捕获复合物的纯度。(B类)内源性Sirt3与复合物I的可逆关联。在喂食条件下（−）、饥饿2或6小时后、过氧化氢（0.5 mM，30分钟）处理后或鱼藤酮（10μM，30 min）处理后，检测免疫捕获复合物I中关联的Sirt3。箭头表示人类Sirt3的长短形态。下面，使用30μg线粒体蛋白裂解物评估每种情况下Sirt3或复合物I组分NDUFA9的总水平。(C类)野生型（+/+）或Sirt3中的ATP水平−/−基本条件下的MEF（黑色条），或暴露于鱼藤酮（50μM；白色条）、氰化物（20μM；阴影条）或过氧化氢（0.5 mM；灰色条）30分钟后。Sirt3中ATP的基本水平降低−/−细胞对鱼藤酮或过氧化氢的挑战具有相对抗性，但对氰化物表现出正常的ATP敏感性。(D类和E类)MEF中NDUFA9的乙酰化水平(D类)或来自野生型（+/+）或Sirt3的肝蛋白裂解物−/−小鼠(E类). (F类)用myc标记的空载体、野生型Sirt3或去乙酰化酶非活性的Sirt3（HY）转染HeLa细胞，并用myc表位抗体或无关的Flag-epitope抗体免疫沉淀等量的裂解物。Sirt3免疫沉淀显示存在共沉淀内源性NDUFA9。免疫沉淀；WB，Western blotting。
图4。
图4。
Sirt3的缺失选择性地影响复合物I的活性。(A类和B类)使用从野生型（a）或Sirt3获得的肝线粒体复合I依赖底物的代表性耗氧率−/−(B类)鼠标。(C类)根据四种野生型和四种Sirt3的完整肝线粒体计算复合物I的状态3呼吸速率−/−小鼠（平均值±SD；*，P（P）< 0.02). (D类)计算出野生型和基因敲除小鼠复合物II依赖底物（琥珀酸盐+鱼藤酮）的状态3呼吸速率。NS，不显著。(E类)纯化HeLa细胞线粒体的NADH消耗率在体外用含有纯化Flag-Sirt4（绿色）、Flag-Sart3（红色）或Flag-vector（紫色）的脱乙酰酶缓冲液培养。在340 nm处监测归一化NADH吸光度。箭头表示添加鱼藤酮的时间（最终浓度为4μM）。所示为两个类似实验之一的三次测定中NADH消耗的平均速率（±SD）。
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