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.2008年11月；82(21):10600-12.
doi:10.1128/JVI.01274-08。 Epub 2008年8月27日。

蓝舌病毒外衣壳蛋白VP5通过SNARE结构域与膜脂筏相互作用

巴塔查里亚主教 1, 波莉·罗伊
附属公司

蓝舌病毒外衣壳蛋白VP5通过SNARE结构域与膜脂筏相互作用

比什努普里亚·巴塔查里亚等。 J维罗尔. 2008年11月.

摘要

蓝舌病毒（BTV）是呼肠孤病毒科的一种非包膜双链RNA病毒。两种外壳蛋白VP2和VP5负责病毒进入。然而，关于这两种蛋白质，特别是VP5在病毒贩运和组装中的作用，人们知之甚少。在本研究中，我们使用密度梯度分馏和甲基β-环糊精（一种胆固醇隔离药物）来证明VP5不仅能与转染细胞和感染细胞中的脂筏结构域共纯化，而且BTV组装需要筏结构域的完整性。此前，我们发现BTV非结构蛋白3（NS3）与VP2相互作用，也与细胞胞吐和ESCRT途径蛋白相互作用，表明其参与了病毒的传播（A.R.Beaton、J.Rodriguez、Y.K.Reddy和P.Roy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:13154-13159，2002；C.Wirblich、B.Bhattacharya和P.罗伊J。维罗尔。80:460-473, 2006). 在这里，我们通过下拉和共焦分析显示，NS3也与VP5相互作用。此外，在VP5序列中鉴定出一个与synaptotagmin中的基序类似的保守膜对接域，synaptogmin是一种属于SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感融合附着蛋白受体）家族的蛋白质。通过定点突变、浮选和共聚焦分析，我们证明VP5的筏结合依赖于这个结构域。总之，这些结果表明VP5具有膜靶向的自主信号，并且VP5与膜相关NS3的相互作用可能在病毒组装中发挥重要作用。

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数字

图1。
图1。
BTV VP5与筏段的迁移。（A） 用冷的1%Triton X-100裂解野生型VP5转染（顶部）和未转染（底部）HeLa细胞，并通过密度梯度分离纯化筏。裂解产物在SDS-PAGE上运行并通过Western blotting进行分析。抗体、分子质量和蔗糖百分比分别显示在右侧、左侧和底部。颗粒级分标记为P。虚线箭头表示不同蛋白质在筏形级分中的定位。（B） VP5与小窝蛋白（红色）（a）、肌动蛋白（红色）（B）、微管蛋白（红色）（c）、钙蛋白酶（红色）（d）和波形蛋白（红色）（e）的IFM共定位。VP5单独的表达如图f所示。
图2。
图2。
胆固醇隔离对细胞的影响。所示为每种mβcdx浓度下死亡细胞的平均百分比。通过台盼蓝染色评估细胞活力。mβcdx的数量和死亡细胞的百分比显示在x个和年轴。实验重复三次，并绘制平均值。标准错误由错误栏指示。
图3。
图3。
BTV VP5筏联合需要胆固醇。表达VP5的HeLa细胞用10 mM mβcdx（左）或未处理的（右）处理，并在蔗糖梯度中分馏。分子量、抗体和蔗糖百分比分别显示在左侧、中间和底部。颗粒部分标记为P。虚线箭头表示筏部分中不同蛋白质的定位。
图4。
图4。
BTV感染细胞中VP5的表达。BTV感染的HeLa细胞中的VP5与筏共分离。感染BTV-17的细胞通过密度梯度离心法进行分析，分别为2、4、6、8、12和16h p.i.未感染的HeLa细胞作为对照。抗体、分子量和蔗糖百分比分别显示在右侧、左侧和底部。颗粒部分标记为P。虚线箭头表示筏部分中不同蛋白质的定位。
图5：。
图5：。
BTV感染细胞中VP5表达的免疫荧光分析。（A） VP5（绿色）在细胞骨架感染HeLa细胞中的定位；波形蛋白（红色）、微管蛋白（红色。每个图像中都给出了时间p.i。箭头表示标记蛋白质的分布。（B） 波形蛋白、微管蛋白和肌动蛋白在对照未感染细胞中的定位。
图6。
图6。
胆固醇缺乏影响BTV-1的产生。（A） 分析感染BTV-17的HeLa细胞（左）和感染BTV-1的BSR细胞（右）的相对病毒滴度。在未经处理和mβcdx（10 mM）处理的细胞中，病毒在每小时8、12和16小时收获。对照未处理样品标记为8c、12c和16c。误差条表示三次重复实验的标准误差。对于未经处理的细胞，每次p.i.的总滴度标准化为100%。（B和C）感染BTV-17（左）或BTV-1（右）的细胞，并分析NS2（B）或微管蛋白（C）的表达。mβcdx的存在和缺失分别显示为+和−。
图7。
图7。
胆固醇提取对BTV蛋白迁移的影响。在第8（顶部）和第16（底部）小时，在没有（左侧）和存在（右侧）10 mM mβcdx的情况下，BTV感染的BSR细胞的分离。抗体、分子量和蔗糖百分比分别在中心、左侧和底部给出。颗粒部分标记为P。虚线箭头表示筏部分中不同蛋白质的定位。
图8。
图8。
VP5与NS3的相互作用。（A） VP5和NS3之间相互作用的下拉分析。用抗NS3（左）或VP5（右）的抗体将裂解液拖出，并用VP5（左）和NS3（右）抗体标记。正负号代表感染细胞和未感染细胞。两个印迹的第1和第2道代表了Sf公司9个与重组杆状病毒（第1道）或未感染（第2道）共感染的细胞。通道3至6为细胞沉淀。底部显示了珠子或抗体的存在，而两侧显示了各自的分子量。（B） 在感染（左）、未感染对照（中）和共转染（右）细胞中表达VP5（绿色）和NS3（红色）的细胞的免疫荧光。
图9：。
图9：。
vp5中潜在raft关联域的映射。（A） 显示BTV血清型1、10和17以及流行性出血性疾病病毒血清型1和2的VP5蛋白序列的比对示意图。完全保守或电荷保守的氨基酸分别用星号和冒号表示。用于诱变的氨基酸以粗体显示。（B） 转染48小时后瞬时转染HeLa细胞中野生型VP5（左）和M1（右）的分布。
图10。
图10。
VP5中的质膜对接基序。（A） HeLa细胞中天然（左）和突变（右）VP5的分离。抗体、分子量和蔗糖百分比分别显示在中间、左侧和底部。颗粒部分标记为P。虚线箭头表示筏部分中不同蛋白质的定位。（B） HeLa细胞中天然（左）和突变（右）VP5的分布。
图11：。
图11：。
携带M1突变的全长VP5的三聚。所示为未变性样本的天然（左）和M1（右）VP5变体的Western blot。注意，三聚体在M5突变体中不受影响。
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