Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation

doi:10.1016/j.molcel.2008.08.004

.2008年8月22日；31(4):520-530.

doi:10.1016/j.molcel.2008.08.004。

H3K4组蛋白去甲基化酶RBP2的全基因组分析揭示了控制分化的转录程序

附属公司

¹西班牙巴塞罗那蓬佩法布拉大学实验与健康科学系生物医学信息学研究室，邮编：08080。
²伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系，地址：美国伊利诺伊州芝加哥市南阿什兰大道900号，邮编：60607。
^三美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心9号怀特海生物医学研究所，邮编02142。
⁴伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系，地址：美国伊利诺伊州芝加哥市南阿什兰大道900号，邮编：60607。电子地址：evb@uic.edu。

PMID： 18722178
预防性维修识别码： PMC3003864项目
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2008.08.004

H3K4组蛋白去甲基化酶RBP2的全基因组分析揭示了控制分化的转录程序

努里亚·洛佩兹·比加斯等。分子电池. 2008.

.2008年8月22日；31(4):520-530.

doi:10.1016/j.molcel.2008.08.004。

附属公司

¹西班牙巴塞罗那蓬佩法布拉大学实验与健康科学系生物医学信息学研究室，邮编：08080。
²伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系，地址：美国伊利诺伊州芝加哥市南阿什兰大道900号，邮编：60607。
^三美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心9号怀特海生物医学研究所，邮编02142。
⁴伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系，地址：美国伊利诺伊州芝加哥市南阿什兰大道900号，邮编：60607。电子地址：evb@uic.edu。

PMID： 18722178
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内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2008.08.004

摘要

视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）通过与多种蛋白质的相互作用介导细胞周期的退出和分化。RB-Binding Protein 2（RBP2）已被证明是一个关键效应器。我们试图通过位置分析和基因表达谱实验确定RBP2全基因组的转录调控。我们描述了RBP2与H3K4me3的存在高度相关，其靶基因被分为两个功能不同的类别：分化依赖型和分化依赖型基因。前者由编码线粒体蛋白质的基因丰富，而后者由细胞周期基因代表。我们证明了RBP2在线粒体生物发生中的作用，包括调节H3K4me3修饰的核小体。RBP2缺失时的表达变化分析显示基因具有分化控制特征，类似于pRB重新引入时的变化。我们的结论是，在分化过程中，RBP2通过与其启动子的直接相互作用对多个基因产生抑制作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。RBP2位置分析数据**
（A）位置分析散点图。来自ChIP的DNA片段用Cy5标记，并与未通过免疫沉淀富集并用Cy3标记的基因组DNA片段进行比较。两个样品都杂交到一个阵列上。RBP2的代表性散点图包括以红色突出显示的编码区域。（B）研究中使用的TPA处理条件下U937细胞增殖和分化的表征。用碘化丙啶和BrdU标记细胞，并用流式细胞术进行分析，以计数增殖细胞和细胞在细胞周期各阶段的分布。流式细胞术检测分化标记CD11b的表达。细胞生长停滞并增加CD11b的表达，这表明它们已经成为分化的单核细胞。（C）分化过程中全基因组RBP2结合的文氏图。圆圈表示特定条件下RBP2目标序列的数量，p值<0.002。三种条件下的单元格数据以不同颜色显示。

**图2。RBP2靶基因和差异表达基因的功能分析**
（A）使用Z记分统计法分析U937和SAOS-2细胞中RBP2的靶基因和差异表达基因，以丰富基因本体术语。该测试测量了在一组基因中，即RBP2靶基因在96小时内（“仅结合96小时”），具有特定GO项的基因比例是否与随机预期存在统计差异。正的Z值表明，在所分析的一组基因中，这一术语丰富。负Z分数表示代表性不足。Z分数以色码标尺显示；红色表示特定GO术语的丰富。蓝色表示GO术语代表性不足。灰色表示无统计显著差异。（B）使用Z记分统计法对细胞周期调节基因和编码线粒体成分的基因进行富集分析。（C）差异表达基因之间的重叠*皇家银行*^−/−SAOS-2细胞在RBP2（RBP2 siRNA）和pRB（pRB）重新引入后耗尽。根据RBP2 siRNA细胞中的折叠变化表达，pRB细胞中过度表达的基因在有序位置以红线显示。类似地，RBP2 siRNA细胞中过度表达的基因根据pRB细胞中表达倍数的变化显示在其有序位置。这些面板显示RBP2 siRNA细胞和pRB细胞中过度表达的基因之间存在高度重叠。

**图3。RBP2与H3K4三甲基化核小体和一些转录因子的共沸**
在RBP2靶基因启动子处H3K4me3富集的统计分析（卡方检验）居首位。RBP2靶基因启动子中预测转录因子结合位点（TFBS）的富集和E2F4、p107和p130靶基因中RBP2目标基因的富集的统计分析（卡方检验）如下。红色方框封装了E2F和ETS响应元件的家族成员。

**图4。RBP2被招募为高活性基因以介导伴随分化的抑制**
（A）在U937细胞中使用细胞周期基因的RBP2抗体的表达分析和ChIP测定。“0”、“96”和“240”是添加TPA后的小时数。实时RT-PCR（qRT-PCR）中使用的相同样本用于基因表达谱分析实验。ChIP结果被标准化为基因间区域20D结合的水平。（B）与27小时相比，96小时内大量RBP2靶基因的表达值较低（负倍变化）。该表显示了卡方检验的结果（p值=0.009）。（C） RBP2过表达后细胞周期基因的表达水平。用RBP2表达质粒进行核感染后，用TPA处理U937细胞96小时，并用qRT-PCR测定表达水平。条形图表示平均值，并显示三个独立实验的标准误差。qRT-PCR数据标准化为*β-2-微球蛋白*(*百万美元*).

**图5。RBP2通过H3K4me3脱甲基作用影响线粒体形态**
（A）将siRNAs转染到RBP2（RBP2 siRNA）、MFN2（MFN2 siRNA。选择细胞作为转染细胞，对HA和线粒体标记物COX4进行固定和免疫染色，或用染色标记氧化还原电位。用DAPI对细胞进行复染，以显示细胞核。图像标记为1到6，代表三个独立实验。比例尺为5µm。（B）（A）实验中细胞线粒体类别的量化。对（A）中的实验1至6进行量化。每次转染约200个细胞后，通过COX4免疫染色观察线粒体。线粒体延伸超过5µm的细胞被视为“长小管”细胞；线粒体较短的细胞被认为是“小管”或“球形/杆状”细胞。结果显示为属于三种形态分类中每一种的细胞百分比。条形图表示具有标准误差的三个独立实验的平均值。（C）的表达式级别*MFN2型*在与（A）中的细胞（从1到4）平行制备的细胞中。条形图表示平均值，并显示两个实验的标准误差。（D） ChIP分析*MFN2型*在转染RBP2或干扰siRNA的SAOS-2细胞中使用H3K4me3特异性抗体的启动子（如[A]中的1和2）。结果显示为*MFN2型*与基因间区26E相关的启动子；平均值和标准误差来自两个独立的实验。（E）的表达式分析*MFN2型*在用TPA处理的U937细胞中。对三种硅酸盐qRT-PCR反应进行分析，以产生平均值和标准误差，并在两个独立的实验中重现。最稳健的时间点*MFN2型*基因表达变化；详细的基因表达谱见图S9。（F） ChIP分析*MFN2型*启动子使用RBP2抗体。（G） ChIP分析*MFN2型*启动子使用H3K4me3特异性抗体。（F）和（G）中的条表示平均值，并带有三个独立实验的标准误差。（C）和（E）–（G）中的归一化如图4所示。

**图6。RBP2调节电路**
RBP2可以占据线粒体功能、核苷酸代谢和细胞周期相关基因的启动子。外部信号将外部条件告知细胞，并通过pRB依赖性传递向下至RBP2导致分化。它启动RBP2对基因的招募及其抑制。总之，这导致了细胞外蛋白的表达，这些蛋白可以通知相邻细胞有关持续分化的信息。

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