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.2008年11月1日；45(9):1232-42.
doi:10.1016/j.freeradbiomed.2008.07.022。 Epub 2008年8月3日。

Bz-423超氧化物通过选择性激活JNK、Bak和Bax发出凋亡信号

尼尔·B·布拉特 1, 安东尼·博伊塔诺, Costas A Lyssiotis公司, 安东尼·W·奥皮帕里（Anthony W Opipari Jr）, 加里·德·格利克
附属机构

Bz-423超氧化物通过选择性激活JNK、Bak和Bax发出凋亡信号

尼尔·B·布拉特等。 自由基生物医学. .

摘要

Bz-423是一种促凋亡的1,4-苯二氮卓类药物，对狼疮和银屑病小鼠模型具有有效的治疗作用。Bz-423调节F（1）F（0）-ATP酶，诱导线粒体呼吸链内超氧物的形成，然后作为启动细胞凋亡的第二信使发挥作用。在此，我们报道了Bz-423在含有关键凋亡蛋白敲除的小鼠胚胎成纤维细胞中激活的信号通路。Bz-423诱导的超氧化物激活胞浆ASK1及其从硫氧还蛋白的释放。随后，有丝分裂原激活的蛋白激酶级联，导致JNK的特异性磷酸化。JNK发出Bax和Bak激活的信号，然后诱导线粒体外膜通透性，导致细胞色素c的释放并导致细胞凋亡。这些细胞对Bz-423的反应严重依赖于作为抗氧化剂的超氧物和JNK活化，JNK抑制剂SP600125可防止Bax移位、细胞色素c释放和细胞死亡。这些结果表明，线粒体呼吸链产生的超氧物作为呼吸转换的结果，可以发出顺序和特异性凋亡反应的信号。总之，这些数据表明，体内观察到的Bz-423的选择性是由于ASK1和Bcl-2蛋白在氧化还原平衡和信号传递方面的细胞类型特异性差异所致。

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数字

图1
图1
Bz-423诱导MEF细胞凋亡。（A） 使用二氢乙硫酸氢钠（DHE）测量超氧化物产生量（1 h）。（B） 细胞色素c（c）Bz-423处理（12μM）指定时间后，通过western blot测定释放到细胞液中的情况。（C） 细胞凋亡（24小时）通过用subG鉴定细胞来测量0DNA含量。（D） 将MEF与指定浓度的Bz-423孵育，然后在不同时间点将Bz-433从培养基中冲出（1小时：浅绿色开放圆圈，3小时：紫色开放方块，5小时：橙色开放方块，7小时：粉红色开放三角形，8小时，棕色倒三角形，10小时：红色方块，12小时：蓝色方块，不洗：黑色三角形）。全培养24小时后，通过碘化丙啶（PI）排除法测定细胞活力。
图2
图2
Bz-423的细胞凋亡需要超氧物。（A–B）在添加Bz-423（12μM）之前，用MnTBAP（30分钟，100μM，灰色条）、PEG-CAT（过夜，200 U/mL，白色条）或载体（黑色条）预处理细胞。通过记录FL2通道中位荧光强度（MFI）作为DHE氧化为乙氧基的标记来测定超氧化物的产生（1 h，面板A）。通过记录FL1通道MFI作为DCF氧化的标记来确定过氧化物形成（1 h，面板B）。（C） 在Bz-423处理（12μM）后，使用或不使用MnTBAP（100μM）或维生素E（100μM）进行预处理（30分钟），在MEF中测量细胞色素C释放到细胞液中。黑色垂直线表示使用来自同一凝胶的非相邻泳道来编制该图。（D）在添加Bz-423（15μM，白色条）之前，用维生素E（30分钟，100μM）、MnTBAP（30分钟，100μM）、PEG-CAT（过夜，300 U/mL）或载体（黑色条）预处理MEF。通过PI排除法测定细胞活力（24 h）。P（P）<0.001，车辆vs MnTBAP，P（P）<0.001，车辆vs维生素E，P（P）=0.45，车辆vs PEG-CAT。（E） 在用载体（实线）或BSO（1mM，虚线）预处理24小时后，用Bz-423培养MEF，并在24小时通过PI排除法测定细胞活力。P（P）车辆与BSO之比<0.05[Bz-423]≥3μM。
图3
图3
Bz-423激活Bak和Bax。（A） MEF在用Bz-423处理（12μM，12 h）和细胞分馏之前，用MnTBAP（100μM）或维生素E（100μM）预处理30 min。免疫印迹法检测细胞或线粒体Bax。黑色垂直线表示来自同一凝胶的非相邻泳道用于编制该图的位置。（B）用载体或Bz-423（12μM，12小时）处理MEF，然后通过免疫荧光显微镜检测活化的N-末端Bax或Bak。
图4
图4
Bak和Bax敲除块Bz-423导致死亡。（A） 使用DHE测量WT MEF（圆形，实线）、Bax中的超氧化物−/−MEF（正方形，长划线），Bak−/−经Bz-423处理（1小时）后的MEF（菱形，短划线）和DKO MEF（“X”，虚线）。（B） 从WT、Bax制备的细胞溶胶组分−/−，贝克−/−用Bz-423（12μM）或对照组处理（12 h）后，分析DKO MEF的细胞色素c（c）ΔΨ米使用DIOC测量6（3） 单位：WT，Bax−/−，巴克−/−Bz-423之后的DKO MEF（12小时）。（D） 细胞凋亡由WT（圆圈，实线）、Bax中的亚二倍体DNA含量测定−/−（正方形，长划线），Bak−/−（菱形，短划线）和DKO MEF（“X”，虚线）。P（P）WT vs Bak<0.01−/−，Bax−/−，或DKO MEF（完全）[Bz-423]>5μM，P（P）<0.01（对于Bak）−/−与DKO MEF相比[Bz-423]>5μM，P（P）Bax<0.01−/−与DKO MEF相比[Bz-423]>7.5μM。（E） 通过PI排除WT、Bax测定细胞活力−/−，贝克−/−Bz-423治疗后（48小时），DKO MEF。P（P）<0.05（WT vs Bak）−/−或Bax−/−所有MEF[Bz-423]>5μM，P（P）WT vs DKO MEF均<0.02[Bz-423]≥2.5μM，P（P）<0.02（对于Bak）−/−在[Bz-423]时，DKO在2.5μM和12.5μM之间，P（P）Bax<0.01−/−与DKO相比[Bz-423]>2.5μM。
图5
图5
对Bz-423的反应中，不良表达增加。（A） 用Bz-423（10μM）处理后，制备裂解物并进行免疫印迹以检测WT、Bax中的Bad蛋白−/−，贝克−/−和DKO MEF。（B） 在使用Bz-423（10μM，2 h）治疗之前，用MnTBAP（100μM）、维生素E（100μM）、CHX（1μg/mL）或载体预处理WT MEF 30 min，然后进行Bad免疫印迹。黑色垂直线表示使用同一凝胶中的非相邻车道来编制该图。（C）用Bz-423处理48小时后，WT（实线）和Bad−/−（虚线）分析MEF以检测含有subG的细胞0DNA含量。P（P）<0.05（WT vs Bad）−/−8和10μM Bz-423的MEF。
图6
图6
CHX抑制Bz-423诱导的细胞凋亡。（A） 在用CHX（1μg/mL，虚线）或载体（实线）预处理（30分钟）后，用Bz-423培养MEF，并用DHE监测超氧化物生成（1小时）。（B） MEF在与Bz-423孵育（12μM，12 h）之前用CHX（1μg/mL）或载体预处理30 min，按指示分馏，并进行免疫印迹检测细胞色素c（c）和Bax。（C） 在用CHX（1μg/mL，虚线）或载体（实线）预处理后，用Bz-423培养MEF，并通过PI排除法测定细胞活力（24 h）。P（P）<0.02（对于车辆）vs CHX（[Bz-423]>10μM）。
图7
图7
Bz-423激活JNK。（A） 用Bz-423（10μM）处理的MEFs制备的裂解物进行免疫印迹，以检测总的和磷酸化的JNK。（B） 在用指示浓度的Bz-423（μM）处理（2 h）后，对总细胞裂解物和磷酸化p38进行免疫印迹。（C） 用Bz-423（10μM）处理MEF制备的裂解液进行免疫印迹，以检测总C-Jun和磷酸化的ATF2。（D） 在使用Bz-423治疗之前（10μM，2 h），用MnTBAP（100μM）、维生素E（100μM）或载体预处理MEF 30 min。免疫印迹全细胞裂解物以检测JNK和磷酸化JNK的表达。黑色垂直线表示使用同一凝胶中的非相邻通道来编制该图。（E）在用SP600125（10μM，虚线）或载具（实线）进行预处理后，用Bz-423培养MEF，并通过PI排除法测定存活率（24小时）。P（P）在[Bz-423]>8μM时，车辆与SP600125的对比值<0.01。（F） 在用SP600125（10μM，虚线）或载体（实线）预处理后，用Bz-423培养MEF，并用DHE检测超氧化物（1h）。
图8
图8
Bz-423激活上游MAP激酶。（A） 用Bz-423（10μM）处理的MEF制备的裂解液进行免疫印迹，以检测总的和磷酸化的MKK4和MKK7。（B） 用Bz-423（12μM）处理后，Thx和ASK1的共免疫沉淀通过免疫沉淀Thx，然后印迹ASK1和Thx的免疫复合物来显示。（C） 用Bz-423（12μM）处理的细胞制备的裂解液进行ASK1免疫沉淀，然后进行印迹检测总ASK1和磷酸化ASK1。
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