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.2008年9月；135(17):2927-37.
doi:10.1242/dev.020842。

PP2A的两个高度相关的调节亚单位对TGF-β/Activin/Nodal信号传导产生相反的作用

朱莉·巴图特 1, 伯恩哈德·施米埃, 荆曹, 劳雷尔·拉弗瑞, 卡罗琳·S·希尔, 迈克尔·豪厄尔
附属公司

PP2A的两个高度相关的调节亚单位对TGF-β/Activin/Nodal信号传导产生相反的作用

朱莉·巴图特等。 开发. 2008年9月.

摘要

我们确定Balpha（PPP2R2A）和Bdelta（PPP2R2 D）是蛋白磷酸酶PP2A调节亚基B家族的两个高度相关的成员，它们是TGF-β/激活素/结节信号的重要调节剂，以相反的方式影响该途径。敲除爪蟾胚胎或哺乳动物组织培养细胞中的Balpha可抑制TGF-β/Activin/Nodal依赖性反应，而敲除Bdelta可增强这些反应。此外，在果蝇中，Smad2的过度表达可挽救由单个果蝇PP2A B亚单位双胞胎的过度表达引起的严重翅膀表型。我们发现，在脊椎动物中，Balpha通过稳定I型受体的基础水平来增强TGF-β/激活素/Nodal信号传导，而Bdelta通过限制受体活性来负面调节这些途径。因此，PP2A调节亚单位同一亚家族的这些高度相关的成员差异性地调节TGF-β/Activin/Nodal信号传导，从而引发相反的生物学结果。

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数字

图1
图1。操纵Bα和Bδ的表达爪蟾胚胎产生不同的表型
(A类)爪蟾胚胎注射对照GFP mRNA、标记小鼠BδmRNA（Bδ）、吗啉对照物（MoC）或特异性吗啉爪蟾Bα（MoBα）或Bδ（MoBδ），并在对照胚胎达到早期原肠胚或尾芽（第25阶段）时固定。图中显示了具有代表性的胚胎，箭头表示前部。胚胎的前部在下面被放大。注意，注射Bδ的胚胎和注射MoBα的胚胎缺乏头部结构。(B类)如A中所示，向胚胎注射所示的mRNA和吗啉酸。与同源mRNA（小鼠Bδ或Bα）共注射可以挽救MoBδ或MoBα的作用。给出了当对照注射胚胎达到22期时，表现野生型表型的胚胎百分比。箭头表示前面。
图2
图2。操纵Bα和Bδ的表达非洲爪蟾胚胎对Activin/Nodal靶基因表达有相反的影响
(A类)原肠期胚胎注射吗啉对照物（MoC）或特定吗啉爪蟾Bα（MoBα）或Bδ（MoBδ）或单细胞期标记小鼠BδmRNA（Bδ）。使用的探针与全球供应链或Xbra公司.用BM紫色显示染色。注意这两个部位的染色增加Xbra公司和Gsc公司在Bδ变体中，Bα变体和过度表达Bδ的胚胎的染色减少。(B类)通过q-PCR分析基因表达。从10.5期胚胎中分离出总RNA，这些胚胎在单细胞期注射吗啉控制或吗啉抗Bα或Bδ。表达水平归一化为鸟氨酸脱羧酶（ODC）。
图3
图3。Bα和Bδ作用于Activin/Nodel信号通路爪蟾
(A至C)向单细胞胚胎注射指定的mRNA（Bα、Bδ或EGFP-Smad2）和吗啉酸（MoC、MoBα或MoBδ）。当对照胚胎达到第8阶段时，切除动物电极，用或不用激活素孵育16小时，并观察延伸程度。
图4
图4。的过度表达果蝇属Smad2（Smox）可以缓解果蝇属B亚单位，翅膀中的双胞胎
(A类)表型野生型翅+/是；UAS-tws23；UAS-Smox8D3男性。(B类)小而起泡的翅膀A9-GAL4；UAS-tws23+男性。这些雄性的所有翅膀都比野生型的小；大约80%的患者出现杯状和水疱，几乎没有静脉迹象。(C类)翼从A9-GAL4；+；UAS-Smox8D3男性。在这个基因型中，翼脉在边缘形成一个三角洲，经常观察到额外的翼脉物质（箭头）。(天)典型现象正常机翼A9-GAL4；UAS-tws23；UAS-Smox8D3男性。所有矿脉在边缘正常终止（箭头）。
图5
图5。Bα和Bδ对磷酸化Smad2水平的影响不同
(A类)胚胎在单细胞期注射吗啉酸（Mo）以对抗Bα或Bδ或BδmRNA，如图所示。在第10阶段采集胚胎，固定，通过嘴唇解剖，并使用抗Smad2和抗β-连环蛋白抗体进行免疫荧光分析。用DAPI对细胞核进行可视化。面板a和b显示腹侧植物区的区域，面板c-e显示背侧植物区。(B类)胚胎保持未注射状态（ui），或注射两次剂量的小鼠BαmRNA或小鼠BδmRNA，培养至对照胚胎达到第9阶段，并用抗磷酸S-Mad2、Smad2/3或磷酸-ERK（pERK）抗体进行免疫印迹分析。(C类)分别向胚胎注射靶向Bδ或Bα的不同吗啉酸（标记为1或2）或对照吗啉酸，并按(B类). (天)将来自第8阶段胚胎的动物帽与冈田酸（OA，25 nM）一起孵育1小时，用或不用激活素处理20分钟，并进行免疫印迹处理。(E类)用siRNA转染HeLa EGFP-Smad2细胞智能池控制或人类Bα或Bδ特异性SMARTpool。用TGF-β孵育细胞，孵育时间为所示时间，并通过共焦显微镜进行固定和可视化。(F类)HeLa EGFP-Smad2细胞在E中转染，并与TGF-β孵育指定时间。样品用抗磷酸S-mad2、抗Smad2/3和抗pan B亚单位抗体进行Western blotting分析。
图6
图6。Bα和Bδ不直接作用于磷酸化Smad2
(A类)分离含Bα-和Bδ-的活性PP2A全复合物并进行磷酸酶分析的实验程序概述。(B类)银染色凝胶，显示通过Flag下拉从转染了所示Flag标记的B亚单位的HeLa细胞中分离的复合物的组成。复合物的成分包括催化亚单位（PP2AC类)和结构亚单位（PP2AA类). *表示标志Bδ覆盖PP2AA类. (C类)免疫纯化复合物的Western blot分析显示存在适当的B或B′δ（PPP2R5D）亚单位（Flag blot）和共纯化催化亚单位（抗PP2A）C类印迹）。以磷酸肽为底物（棒状物），通过比色法评估磷酸酶活性。(天)将PP2A复合物（如（C）所示）与从TGF-β诱导的HaCaT-EGFP-Smad2细胞中免疫纯化的磷酸化S-mad2孵育。然后用抗pSmad2和抗Smad2/3抗体进行免疫印迹分析反应。所有测试的PP2A复合物都未能使磷酸化S-mad2脱磷酸。免疫沉淀HA标记Raf-1的Bα-和Bδ-复合物去磷酸化pS259（下面板）(E类)在PP2A复合物免疫纯化之前，TGF-β处理不会影响共纯化催化亚单位的数量，也不会影响比色分析中复合物的活性。(F类)如（D）所示，但PP2A复合物是从未经处理的（-）或TGF-β诱导的细胞（+）中提纯的，如（E）所示。(G公司)Smad2的磷酸化丝氨酸245、250和255不是免疫纯化Bα和Bδ复合物的底物。从对照细胞（C）或表达标记Bα或Bδ的细胞免疫纯化磷酸酶复合物，并与TGF-β诱导的HaCaT细胞（上面板）的Smad2/3免疫沉淀物或表达HA-Raf的HeLa细胞（下面板）的免疫纯化磷酸化Raf底物孵育。使用识别在残基S245、S250、S255磷酸化的Smad2以及所示的抗Smad2/3、抗磷酸Raf和抗HA的抗体，通过Western blotting对样品进行分析。
图7
图7。Bα调节I型受体的基础水平，Bδ调节其活性
(A类)分离含Bα-和Bδ-的活性PP2A全息复合物并测定其影响ALK5激酶活性的能力的实验程序概述。(B类)PP2A复合物的存在均不影响体外ALK5的激酶活性。在不存在或存在如图6所示纯化的B亚单位特异性PP2A复合物的情况下，用重组Smad2底物培养从未经处理或TGF-β处理的HaCaT细胞免疫纯化的内源性ALK5复合物。免疫印迹法检测C末端Smad2磷酸化。PP2A复合物的活性通过其对Raf-1（下面板）的pS259进行去磷酸化的能力得到证实。(C类)敲除Bδ促进ALK4聚集。将胚胎中单独表达HA-ALK4 mRNA或与吗啉结合表达抗Bδ（MoBδ，中间面板）的动物帽在有或无激活素的条件下孵育1小时，并用抗HA抗体染色。HA-ALK4簇对Activin和注射MoBδ的未处理胚胎的反应。冈田酸（OA）处理（下部面板）也诱导HA-ALK4聚集，从而模拟Bδ击倒。(天)Bα敲除强烈降低ALK5的基础蛋白水平。如图所示，用siRNAs转染HaCaT细胞并用TGF-β处理。用抗ALK5、磷酸化S-mad2、泛B亚基和Smad2/3的抗体对提取物进行免疫印迹。(E类)Bα敲低对TβR-II水平没有影响。用所示的siRNA转染HaCaT细胞。用TβR-II、泛B亚单位和Smad2/3抗体对提取物进行免疫印迹。电泳前，对提取物进行±PNGase F处理，以去除TβR-II中的N-连接糖，并使其更清晰地显示出来。(F类)Bα敲除或Bδ过度表达降低HA-ALK4的蛋白水平。在单细胞期注射HA-ALK4和GFP mRNA以及吗啉酸或BδmRNA，培养至未注射胚胎（Ui）达到第9阶段，并进行免疫印迹分析。(G公司)Bα和Bδ对TGF-β/Activin/Nodal信号的调制模型。Bα通常稳定I型受体ALK4和ALK5，Bα的敲除促进其基础降解。Bδ通常限制ALK4和ALK5的配体依赖性激活，而Bδ的敲除促进了这种激活。当过表达时，由于Bδ对催化亚单位的亲和力较高，Bδ通过在PP2A全酶中替换它来额外抑制内源性Bα。
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