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.2008年9月;36(16):5362-75.
doi:10.1093/nar/gkn503。 Epub 2008年8月12日。

剖析p53磷酸化在同源重组中的作用为获得功能突变体提供了新线索

附属公司

解析p53磷酸化在同源重组中的作用为功能获得突变体提供了新的线索

Anja Restle公司等。 核酸研究. 2008年9月.

摘要

同源重组调控(HR)代表了p53最具特征的DNA修复功能。p53磷酸化在DNA修复中的作用尚不清楚。这里,我们显示野生型p53以部分需要ATM/ATR磷酸化位点丝氨酸15的方式抑制HR对DNA双链断裂(DSB)的修复。Cdk介导的丝氨酸315磷酸化对这种抗重组作用是必不可少的。然而,如果没有HR底物的靶向裂解,丝氨酸315磷酸化对于p53激活依赖拓扑异构酶I的HR是必要的。此外,细胞周期蛋白A1的过度表达,模拟了肿瘤中的情况,在存在致癌p53突变体(而非Wtp53)的情况下,不适当地刺激了DSB诱导的HR。这种效应需要细胞周期蛋白A1/cdk介导的磷酸化才能与拓扑异构酶I形成稳定的复合物。我们得出的结论是,p53突变体失去了HR激活和抑制之间的平衡,这导致潜在诱变DNA重排的净增加。我们的数据为突变体p53在基因组不稳定中获得功能的机制提供了新的见解。

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数字

图1。
图1。
N端和C端磷酸化位点突变的p53蛋白表达后的HR分析。(A类)HR分析底物HR-EGFP/3示意图EGFP,它允许在I-SceI介导的卵裂后通过FACS量化同源DSB修复(21)。(B类)KMV(人力资源/3)用pCMV-I-SceI和pKEX(对照)或pKEX衍生物对细胞进行电穿孔,以表达大鼠的Wt和突变型(174Y,15A,4/6A,390A,310/313A)p53,并培养72h。重组频率被确定为绿色荧光细胞相对于总细胞数的分数,并在每种情况下归一化为单个转染效率。列,平均值(n个= 6); 钢筋,SEM(C类)从转染的KMV(HR/3)制备总细胞匀浆)免疫印迹法分析细胞及p53、p21和RAD51的含量。
图2。
图2。
ATM/ATR介导的磷酸化的影响。(A类)如图1所示,在KMV(HR/3′)细胞中,使用与人类雌激素受体激素结合域融合的人类p53表达质粒pSVp53her(Wt)、pSVp53(15A)her、pSVp53(1-333)her或pBS(对照),在没有或存在400μM咖啡因的情况下,对染色体底物的同源DSB修复进行检测(A类)或2μM CGK(B类). 无p53的细胞中的重组频率设置为100%[(A)和(B)中的绝对平均值:1.0×10−3]. 列,平均值(n个= 3–9); 棒材,SEM(C类)咖啡因和CGK处理后,p53her和p53(15A)her的表达相等,丝氨酸15处p53hers的磷酸化降低。
图3。
图3。
C末端p53磷酸化位点突变的HR调节。(A类)使用人类p53表达质粒pCMV-p53(273H)、pCMV-Wtp53、pCMV-p53(315A)、pCMCV-p32(392A)、p CMV-p53(392D)或空载体(对照)修复染色体同源性DSB。不含p53的细胞中的重组频率设置为100%(绝对平均值:2.0×10−3). 列,平均值(n个= 6–12); 钢筋,SEM(B类)p53、RAD51和p21的Western blot分析。
图4。
图4。
p53介导topo I被击倒后的HR调节(A类)和(B类)KMV(HR/3′)细胞转染pCMV-Wtp53、pCMV-p53(315A)、pCMV-p53(273H)、pCMCV-p32(248W)或空载体(对照)和pSUPER(−)或pSUPER-TopoI(+)进行拓扑异构酶特异性RNA干扰,并进行HR测量。对于(B)中I-SceI介导的底物切割,pCMV-I-SceI被包括在转染混合物中。p53阴性细胞与pSUPER的重组频率设置为100%(绝对平均值:2.7×10−5无I-SceI和2.0×10−3与I-SceI)。列,分别为12至41(A)和六(B)次测量的平均值;钢筋,SEM。
图5。
图5。
细胞周期蛋白A1和A2对不同p53和topo I状态细胞中同源DSB修复的影响。(A类)在与pCMV-I-SceI共转染的KMV(HR/3′)细胞和pCMV-Wtp53、pCMV-p53(315A)、pCMV-p53(273H)、pCMCV-p53或空载体(对照)以及pcDNA3-细胞周期蛋白A1(A1)、pCM V-cyclin A2(A2)或空载体中检测DSB-诱导的HR。列,平均值(n个= 12–27); 钢筋,SEM(B类)与pSUPER共转染的DSB诱导过度表达细胞周期蛋白A1的细胞HR()或pSUPER TopoI(+)。列,平均值(n个= 12–18); 钢筋,SEM(C类)与pSUPER(−)或pSUPER-TopoI(+)共转染后,DSB在过度表达细胞周期蛋白A2的细胞中诱导HR。列,平均值(n个= 6); 对照组的重组频率设置为100%((A)−p53/−cyclins的绝对平均值:2.1×10−3; 在(B)−p53/+细胞周期蛋白A1/−pSUPER TopoI:2.2×10中−3; in(C)−p53/+细胞周期蛋白A2/−pSUPER-TopoI:2.8×10−3). (D类)与p53表达相比,pSUPER-TopoI介导的topo I蛋白下调。(E类)细胞周期蛋白A1和细胞周期蛋白A2的蛋白质印迹。
图6。
图6。
cdk抑制对细胞周期蛋白A1和突变型p53调节HR的影响。(A类)DMSO(−)或80μM olomoucine(+)处理的KMV(HR/3′)细胞中DSB诱导的HR。对照组−p53/−cyclin A1/−olomoucine的重组频率设置为100%(绝对平均值:1.1×10−3). 列,平均值(n个= 12–18); 钢筋,SEM(B类)p53pSer315和p53的免疫印迹分析。(C类)细胞周期分析。列,平均值(n个= 2); 巴,标准偏差。
图7。
图7。
cdk2敲除后细胞周期蛋白A1和突变型p53对HR的调节。(A类)DSB诱导KMV(HR/3′)细胞HR,与空载体或pKD-cdk2-v5(pKD-cd k2)共转染,用于cdk2-特异性RNA干扰。对照组−p53/−cyclin A1/−pKD-cdk2的重组频率设置为100%(绝对平均值:1.2×10−3). 列,平均值(n个= 6); 钢筋,SEM(B类)cdk2的Western blot分析。
图8。
图8。
细胞周期蛋白A1增强topo I和p53的协同免疫沉淀。用pCMV-I-SceI加空表达载体(对照)、pCMV-p53(248W)或pCMV-Wtp53加空载体或pcDNA3-环素A1电穿孔KMV(HR/3′)细胞,并用DMSO(−)或80μM olomoucine处理,如图6所示。20小时后,制备了无[p53(248W)]或染色质复合物交联(Wtp53)的全细胞提取物体内并用Scl-70血清免疫沉淀topo I,然后用p53或topo I的蛋白质印迹。作为非特异性topo I相互作用的阴性对照,用抗GAPDH抗体(IgG)免疫沉淀提取物。空载体对照排除了来自分子量类似于p53的重链的western blot中的非特异性信号。
图9。
图9。
提出了肿瘤突变型p53导致基因组不稳定的细胞周期蛋白A1诱导机制模型。

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