跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2008年8月；10(8):873-85.
doi:10.1593/neo.07842。

BH3模拟物激活耐缺氧恶性胶质瘤细胞的自噬细胞死亡

霍尔格·赫奇科 1, 瓦莱丽·沃斯, 克里斯蒂安·森夫特, 沃尔克·塞弗特, Jochen H M Prehn先生, 多纳特·科格尔
附属公司

BH3模拟物激活耐缺氧恶性胶质瘤细胞的自噬细胞死亡

霍尔格·赫施科等。 肿瘤形成. 2008年8月.

摘要

在这里，我们研究了Bcl-2家族成员在恶性胶质瘤缺氧耐受中的特殊作用。流式细胞术对17个胶质瘤细胞株的细胞死亡分析显示，它们对吸氧的敏感性存在显著差异（<0.1%O（2））。细胞死亡与线粒体去极化、细胞色素C释放和绿色荧光蛋白（GFP）标记的轻链3向自噬体的移位有关，但发生在缺乏半胱氨酸酶激活或磷脂酰丝氨酸暴露的情况下。在敏感和耐受的胶质瘤细胞系中，缺氧导致BH3-only基因的显著上调，之前这些基因与介导其他细胞类型（BNIP3、NIX、PUMA和Noxa）的缺氧细胞死亡有关。相比之下，我们检测到缺氧耐受性与抗凋亡Bcl-2家族蛋白Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1的高表达水平之间存在强烈的相关性，这些蛋白具有中和BH3-only蛋白促凋亡活性的功能。重要的是，用小分子BH3模拟物HA14-1和BH3I-2'抑制Bcl-2和Bcl-xL，并通过RNA干扰重新激活先前耐药的胶质瘤细胞中缺氧诱导的自噬细胞死亡。我们的数据表明，内源性BH3-only蛋白诱导可能无法补偿缺氧耐受性星形细胞瘤中抗凋亡Bcl-2家族蛋白的高表达。他们还支持BH3模拟物可能代表一种令人兴奋的治疗恶性胶质瘤的新方法的推测。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
恶性胶质瘤细胞株在缺氧敏感性方面表现出高度的变异性。（A） 细胞系U87、U343和U373以大约40%的汇合光密度播种，并在指定的时间内经受常氧或缺氧。细胞死亡通过PI摄取的流式细胞术分析进行量化。数据为平均值±SEMn个=4种培养物*P（P）与常氧对照组相比<0.05。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。（B） 将6个对缺氧反应高度可变的细胞系（见表1）的细胞接种在约40%的汇合光密度下。24小时后，细胞在缺氧或常压条件下培养48小时，并用Annexin V和PI染色。使用流式细胞术测定细胞死亡，并汇总Annexin V-、AnnexinV/PI-和PI-阳性细胞的百分比。数据为平均值±SEMn个=4种培养基*P（P）与常氧对照组相比<0.05。在三个单独的实验中获得了类似的结果。
图2
图2
缺氧诱导恶性胶质瘤中caspase非依赖型细胞死亡。（A） 代表性点图和（B）缺氧耐受性U343和缺氧敏感性MZ-54细胞的细胞死亡定量。用zVAD（200）预处理细胞µM） 持续2小时。在存在或不存在zVAD的情况下，在常氧或缺氧培养48小时后，用膜联蛋白V/PI染色和流式细胞术定量细胞凋亡。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与DMSO处理的细胞相比，<0.05。（C） 在常氧或缺氧（48小时）暴露后，对胶质瘤细胞株U343、MZ-18、U251、U87、U373和MZ-54进行caspase-3样活性测定。作为阳性对照，HeLa细胞用载体（DMSO）或STS（3µM、 6小时）。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与常氧对照组相比<0.05。不另说明。表示不重要。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。
图3
图3
缺氧诱导的细胞死亡与缺氧敏感胶质瘤细胞的自噬相关。（A） 用编码GFP-LC3的质粒转染U343细胞（上面板）和MZ-54细胞（下面板）。转染后24小时，细胞缺氧48小时。作为诱导自噬的阳性对照，细胞也用25µM C2-乙酰胺24小时。固定后，用Hoechst 33258对细胞进行染色，并用表观荧光显微镜进行分析。实验重复了两次，结果相似。比例尺，=10µm.（B）定量评估含有GFP-LC3阳性自噬体的胶质瘤细胞。用编码GFP-LC3的质粒转染耐缺氧（U343）和耐缺氧（MZ-54）细胞株。转染后24小时，用caspase抑制剂zVAD（200µM） 在常氧和缺氧条件下再培养48小时。在两个单独的实验中获得了类似的结果。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与正常氧对照组相比<.05。不另说明。表明在没有zVAD的情况下，与各自的治疗相比没有显著性差异。
图4
图4
缺氧诱导缺氧敏感性胶质瘤细胞线粒体功能障碍和Bax移位。（A） 将胶质瘤细胞系U343、MZ-18、U251、U87、U373和MZ-54暴露于常氧、缺氧（48小时）或用5µM STS（24小时），然后用TMRM染色，然后用流式细胞仪测量TMRM荧光。HeLa细胞作为对照。数据显示为与每个细胞系（常氧）对照组相比保留的荧光百分比。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与常氧对照组相比<0.05。在两个单独的实验中获得了类似的结果。（B） 缺氧条件下GFP标记Bax在缺氧敏感胶质瘤细胞中的移位。转染GFP-Bax、U343（上面板）或MZ-54细胞（下面板）后24小时暴露于缺氧或在常压条件下培养24小时。固定后，用Hoechst 3342（1）进行细胞色素C免疫染色和细胞核染色µ克/µl） 用荧光显微镜对细胞进行分析。比例尺，10µm.（C）显示细胞色素的细胞的量化C类缺氧诱导细胞死亡期间U343和MZ-54培养物中的释放。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化。#P（P）与常氧对照组相比<0.05。不另说明。表示不重要。
图5
图5
仅BH3基因在缺氧敏感和耐缺氧神经胶质瘤细胞中的诱导作用。（A） 缺氧48小时后BNIP3和BNIP3L/NIX诱导的Western blot分析。将所示胶质瘤细胞株在常压（N）和缺氧（A）条件下培养48小时，并用BNIP3和BNIP3L/NIX抗体检测全细胞裂解物。α-管蛋白作为负荷控制。（B） 用qPCR分析BH3-only基因的表达。U343和MZ-54细胞在缺氧或常压条件下培养24小时，然后用实时定量PCR分析总RNA。BH3-only转录物BNIP3、BNIP3L/NIX、Noxa和Puma的表达分析各进行40个周期。TATA-结合蛋白作为内部对照（40个周期）。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与常氧对照组相比<0.05。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。
图6
图6
Western blot分析六种胶质瘤细胞系中促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成员的表达水平。用抗Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1（抗凋亡成员）以及抗Bak和Bax（促凋亡成员）的抗体检测全细胞裂解物。α-微管蛋白作为负载对照。在两个单独的实验中获得了类似的结果。
图7
图7
GFP-标记的BNIP3异位过度表达诱导缺氧敏感性MZ-54细胞死亡。（A） 转染GFP-BNIP3、U343和MZ-54细胞后24小时，暴露于缺氧或在常压条件下培养24小时，收获并用PI染色。流式细胞仪分析鉴定绿色荧光蛋白/PI阳性细胞。缺失N末端和C末端跨膜结构域的截断GFP-BNIP3作为阴性对照。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与常氧对照组相比<0.05。#P（P）<0.05，与相应的正常对照组的差异。（B） GFP-BNIP3核定位细胞的定量分析。转染GFP-BNIP3、U343或MZ-54细胞后24小时，暴露于缺氧或在常氧条件下培养24小时，用Hoechst 3342（1µ克/µl） ，并进行荧光显微镜检查。数据为平均值±SEMn个=5种独立的文化*与常氧对照组相比，P<0.05。不另说明。表示不重要。（C） 缺氧期间BNIP3的线粒体易位。如前所述处理U343和MZ-54细胞。比例尺，10µm.（D）缺氧期间通过GFP-BNP3的瞬时过表达进行的溶酶体诱导。转染GFP-BNIP3或tBNIP3（对照）后2小时，U343和MZ-54细胞暴露于缺氧或在常压条件下培养24小时。将细胞进行胰蛋白酶化，用Lysotracker Red DND-99染色，并用流式细胞仪分析GFP阳性细胞。数据以折叠变化形式给出与对照转染的各细胞系的正常毒性培养物。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与常氧对照组相比<0.05。#P（P）<.05，与转染tBnip3控制质粒的细胞的差异。在MZ-54细胞的Lysotracker红染色后获得的代表性FACS图谱显示在（E）中。
图8
图8
抑制Bcl-2和Bcl-xL可重新激活缺氧耐受性胶质瘤细胞中缺氧诱导的细胞死亡。U343和MZ-54细胞用20µM BH3I-2′（A）和30µM HA14-1（B）持续1小时。之后，将细胞置于缺氧状态48小时或在常氧条件下培养。细胞用Annexin V和PI染色，用流式细胞仪检测细胞死亡。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与常氧对照组相比<0.05。在至少两个单独的实验中也得到了类似的结果。
图9
图9
BH3模拟物增加了缺氧条件下含有GFP-LC3阳性自噬体的细胞数量。（A） 用编码GFP-LC3的质粒转染耐缺氧U343）和耐缺氧MZ-54细胞株。转染后24小时，用20µM BH3I-2′和30µM HA14-1培养1小时，并在常氧和缺氧条件下再培养48小时。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化*P（P）与常氧对照组相比<0.05。#P（P）与未添加BH3模拟物的各治疗组相比，<0.05。在至少两个单独的实验中也得到了类似的结果。（B） MZ-54细胞自噬的典型图像。如前所述处理细胞，固定，并通过荧光显微镜分析GF P-LC3的亚细胞定位。比例尺，10µ米。
图10
图10
RNA干扰对抗凋亡Bcl-2家族成员的特异性敲低导致缺氧条件下细胞死亡增加。用打乱的对照siRNA、Bcl-2 siRNA或Bcl-xL siRNA转染耐缺氧（U343）和耐缺氧（MZ-54）细胞株。通过Western blot分析证实Bcl-2（A）和Bcl-xL（B）的敲除，α-微管蛋白作为负荷对照。Bcl-2和Bcl-xL的敲除导致缺氧条件下缺氧敏感MZ-54细胞和缺氧耐受U343细胞的细胞死亡增加。通过Annexin V/PI染色的流式细胞术分析，在缺氧48小时后量化细胞死亡。数据为平均值±SEMn个=4种独立的文化。#P（P）与加扰siRNA对照相比<0.05。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Maher EA、Furnari FB、Bachoo RM、Rowitch DH、Louis DN、Cavenee WK、DePinho RA。恶性胶质瘤：一个严重问题的遗传学和生物学。基因开发2001；15:1311–1333.-公共医学
    1. Kleihues P、Louis DN、Scheithauer BW、Rorke LB、Reifenberger G、Burger PC、Cavenee WK。WHO神经系统肿瘤分类。神经病理学实验神经学杂志。2002;61:215–225. 讨论226-229。-公共医学
    1. Turcotte ML、Parliament M、Franko A、Allalunis-Turner J.低氧敏感性和低氧耐受性人脑胶质瘤细胞线粒体功能的变化。英国癌症杂志。2002;86:619–624。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Carmeliet P，Jain RK。癌症和其他疾病中的血管生成。自然。2000;407:249–257.-公共医学
    1. Yancopoulos GD、Davis S、Gale NW、Rudge JS、Wiegand SJ、Holash J.血管特异性生长因子和血管形成。自然。2000;407:242–248.-公共医学

出版物类型

MeSH术语

物质