Phosphorylation and ankyrin-G binding of the C-terminal domain regulate targeting and function of the ammonium transporter RhBG

doi:10.1074/jbc.M803120200

.2008年9月26日；283(39):26557-67.

doi:10.1074/jbc。M803120200之间。 Epub 2008年7月17日。

C末端结构域的磷酸化和锚蛋白G结合调节氨转运蛋白RhBG的靶向性和功能

法比安·索赫特¹, 伊夫·科林, Sandrine Genetet公司, 皮埃尔·里波什, 西尔万·梅特拉尔, 卡罗琳·勒凡·金, 克劳德·洛佩兹

附属公司

PMID： 18635543
预防性维修识别码： PMC3258915型
内政部： 10.1074/jbc。M803120200

C末端结构域的磷酸化和锚蛋白G结合调节氨转运蛋白RhBG的靶向性和功能

法比安·索赫特等。生物化学杂志. 2008.

.2008年9月26日；283(39):26557-67.

doi:10.1074/jbc。M803120200。 Epub 2008年7月17日。

作者

法比安·索赫特¹, 伊夫·科林, Sandrine基因, 皮埃尔·里波什, 西尔万·梅特拉尔, 卡罗琳·勒凡·金, 克劳德·洛佩兹

附属

¹INSERM，U665，巴黎F-75015，法国巴黎亚历山大·卡巴内尔街6号国家输血研究所，法国F-75015。

PMID： 18635543
预防性维修识别码： PMC3258915型
内政部： 10.1074/jbc。M803120200

摘要

RhBG是氨转运体Amt/Mep/Rh/超家族的人类成员，已被证明有助于NH（3）的转运，并通过锚蛋白G锚定在肾上皮细胞的基底外侧质膜上。我们在这里显示了（419）FLD（421）序列的三丙氨酸取代，它将RhBG的细胞质C末端结构域与锚蛋白G连接起来，不仅破坏了Rh BG与基于光谱的骨架的相互作用，还延迟了其细胞表面表达，降低了其质膜稳定性，并取消了其在上皮细胞系中的NH（3）转运功能。类似地，我们证明了锚定到膜骨架和铵转运活性都受RhBG C末端尾部磷酸化状态的调节。酪氨酸429属于先前报道的RhBG的YED基底侧靶向信号，在体外使用纯化的Src和Syk激酶进行磷酸化，在体外通过分析渗透酸盐处理对野生型RhBG-或Y429A突变体的影响进行磷酸化。然后，我们发现Y429D和Y429E突变，模拟组成性磷酸化，阻断NH（3）转运并增强Triton X-100对细胞膜RhBG的溶解。相比之下，非磷酸化/非磷酸化Y429A和Y429F突变体的表现与野生型RhBG相同。相反，残基429的Y/A或Y/F突变而非Y/E或Y/D突变可消除RhBG在极化上皮细胞中的唯一基底外侧定位。所有这些结果导致了一个模型，在该模型中，RhBG的靶向和铵转运功能受到C末端细胞质结构域的磷酸化和膜骨架结合的调节。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**人RhBG胞质C端氨基酸序列（RhBG-Cter）。**FLD锚蛋白-G相互作用域与YED靶向信号先前已识别(31). 终端DTQA序列符合可能的I型PDZ结合基序。潜在磷酸化站点表示为*星号。TM-12型*，RhBG的多面体结构胞质C末端上游有12个跨膜结构域。

**图2。**
**RhBG C表达的免疫荧光显微镜分析HEK293细胞中的末端突变体。**HEK293克隆转染了一个空的pcDNA3载体(清空)，或表示野生型(*RhBG公司*)，或突变体RhBG在poly上培养-我-赖氨酸盖玻片并固定4%多聚甲醛。A类，细胞在1%SDS中渗透兔抗RhBG-Cter和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG染色。B类，用小鼠腹水A-08和Alexa直接标记细胞Fluor 488山羊抗鼠IgG。S422D、S426A、S426D、Y429A、Y429%、T456A和T456D（未显示）在A类和独家表面标签*B.比例尺*, 15微米。

**图3。**
**HEK293细胞表达荧光变化的典型时间过程RhBG C末端突变体并暴露于铵梯度。**加载的单元格用荧光pH敏感探针将BCECF-AM暴露于等渗向内20 mEq NH⁺₄坡度为15摄氏度。酸碱度_我-监测依赖性荧光变化使用停流荧光分光光度计。七至九个时间段的数据使用单纯形求平均值并拟合为单指数函数Biokine软件（Bio-Logic）的程序，根据该程序，碱化率常数(k个，秒^-1)计算。重量，父母HEK293细胞。S422D、S426A、S426D、Y429F、454停止、T456A和T456D（非所示）显示了与S422A和Y429A类似的时间进程。Y429D剖面（未显示）类似于Y429E和F419A/L420A/D421A。所有实验重复至少三到四次以获得k个中的值表1。

**图4。**
**RhBG在Tyr的磷酸化⁴²⁹.** *A、顶部面板*,纯化的重组GST、GST-Cter和GST-Ctor Y429A在*E.公司。大肠杆菌*用Western blot分析GST蛋白磷酸化抗磷酸酪氨酸对-Tyr-100抗体。*底部面板*，蓬松红不同GST结构的染色。*B、顶部面板*、GST蛋白在[γ]存在下磷酸化-³²P] 纯化ATPSrc或Syk激酶。通过放射自显影术分析磷酸化(³²P） ●●●●。*底部面板*，胭脂红染色。C类,渗透汽化物对NH的影响_三HEK293细胞的转运效率表达RhBG或Y429A。运输效率表示为相对碱化速率常数值修正为膜表达本地RhBG，如表中所示1

**图5。**
**Tyr的靶向⁴²⁹极化MDCK中RhBG的突变体细胞。** A类共聚焦显微镜切片。表达MDCK克隆野生型(*RhBG公司*)或突变体RhBG过滤生长7天用于间接免疫荧光显微镜。细胞固定在加入兔抗RhBG Cter和小鼠抗ZO-1之前透化抗体。ZO-1（闭塞小带）是紧密连接的标志划分顶端和基外侧区域。Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 568山羊抗鼠IgG用作第二抗体，分别是。*顶部面板*，XY水平中间部分(*面对面意见*)显示本地和突变克隆中的RhBG标记。*底部面板*、XZ截面(*侧视图*)显示两个RhBG(绿色)和ZO-1(红色)染色。Y429A和Y429D（非所示）分别显示出与Y429F和Y429E相同的RhBG分布。*比例尺*，15微米。B类，检测到细胞表面分布通过区域选择性生物素化。过滤培养的MDCK细胞代谢标记为[³⁵S] 蛋氨酸/[³⁵S] 半胱氨酸与表面从顶端生物素化(*Ap公司*)或基底外侧(*Bl公司*)侧面。裂解后，RhBG总蛋白被免疫沉淀使用抗RhBG-Cter，用亲和素分离生物素化蛋白珠子。对生物素化的RhBG蛋白进行SDS-PAGE，电转移到硝化纤维素膜上，并进行放射自显影。Y429A型（Ap 35%/Bl 65%）和Y429D（Ap 8%/Bl 92%）（未显示）显示分布分别类似于Y429F和Y429E。百分比值是两个独立的实验。

**图6。**
**RhBG、Y429F、Y429 E和F419A/L420A/D421A的Triton X-100可萃取性来自HEK293和极化的MDCK细胞。**高铁293(A类)或极化MDCK公司(B类)表达野生型的细胞(*RhBG公司*)或突变型RhBG在Triton X-100浓度（%）增加的情况下进行裂解表明。用Western blot分析总提取蛋白。*顶部面板*，RhBG蛋白（50–55 kDa），使用抗RhBGA-08发现。*底部面板*、内源性细胞质Erk1和Erk2蛋白（42–44 kDa）。

**图7。**
**RhBG、Y429F、Y429 E和F419A/L420A/D421A的交付和营业额HEK293细胞表面。**HEK293细胞表达提尔⁴²⁹或锚蛋白G结合位点被脉冲相标记([³⁵S] 蛋氨酸/[³⁵S] 半胱氨酸）和总膜蛋白质被生物素化和免疫沉淀。A类，新交付通过放射自显影术监测细胞表面的RhBG蛋白生物素化蛋白质。血浆中表达的RhBG蛋白总量用抗RhBG蛋白免疫印迹法测定每个追逐时间的细胞膜A-08。B类，曲线显示了放射性标记生物素化的比率膜上的RhBG/总生物素化RhBG反映了新的随着时间的推移，在细胞表面传递天然或突变RhBG。这个曲线表示三个实验的平均值。♦, RhBG；▪Y429F；⋄，Y429E；▵, F419A/L420A/D421A。

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