Ca2+ handling is altered when arterial myocytes progress from a contractile to a proliferative phenotype in culture

doi:10.1152/ajpcell.00173.2008

.2008年9月；295（3）：C779-90。

doi:10.1152/ajpcell.00173.2008。 Epub 2008年7月2日。

当培养的动脉肌细胞从收缩型向增殖型发展时，Ca2+处理发生改变

罗伯特·贝拉·罗曼尼¹, Amparo Mazzocco-Spezzia水瓶, 玛丽亚·V·普利纳, 维拉·戈洛维纳

附属公司

PMID： 18596214
预防性维修识别码： PMC2544451型
内政部： 10.1152/ajpcell.00173.2008

当动脉肌细胞在培养中从收缩表型发展为增殖表型时，Ca2+处理发生改变

罗伯特·贝拉·罗曼尼等。美国生理学杂志细胞生理学. 2008年9月.

.2008年9月；295（3）：C779-90。

doi:10.1152/ajpcell.00173.2008。 Epub 2008年7月2日。

作者

罗伯特·贝拉·罗曼尼¹, Amparo Mazzocco-Spezzia水瓶, 玛丽亚·V·普利纳, 维拉·戈洛维纳

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩市马里兰大学医学院生理学系，邮编：21201。

PMID： 18596214
预防性维修识别码： PMC2544451型
内政部： 10.1152/ajpcell.00173.2008

摘要

血管肌细胞的表型调控对血管的发育和适应至关重要。这一过程的一个特征是细胞内Ca（2+）处理的改变，这一点尚不完全清楚。我们研究了1，4，5-三磷酸肌醇（IP（3））-和赖氨酸（Ry）-敏感的Ca（2+）储存、储存操作的Ca（2+）进入（SOCE）和受体操作的Ca（2+）进入（ROCE）的功能变化的机制，这些变化与培养中动脉肌细胞从收缩表型调节为增殖表型有关。从大鼠肠系膜动脉中增殖培养的心肌细胞具有升高的静息细胞溶质Ca（2+）水平和增加的IP（3）敏感性Ca（2+）储存量。在无Ca（2+）介质中，ATP和环己二酸[CPA；一种肌（内）质网Ca（2+）-ATPase（SERCA）抑制剂]诱导的Ca（2+）瞬变在增殖的动脉平滑肌细胞（ASMCs）中显著大于新鲜分离的肌细胞，而咖啡因（Caf）诱导的Ca2+释放则小得多。此外，在细胞培养过程中，Caf/Ry敏感存储区对Caf激活逐渐失去敏感性。这些变化可以通过所有三个IP（3）受体的表达增加以及增殖过程中Ry受体II型向III型表达的转变来解释。SOCE由IP（3）/CPA敏感储存的耗竭激活，在增殖的ASMC中显著增加。增殖心肌细胞中增加的SOCE和ROCE（由二酰甘油类似物1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油激活）可归因于瞬时受体电位蛋白TRPC1/4/5和TRPC3/6的上调表达。此外，基质相互作用分子1（STIM1）和Orai蛋白在增殖细胞中上调。增殖的ASMC中IP（3）受体、SERCA2b、TRPC、Orai（s）和STIM1的表达增加表明，这些蛋白在血管生长和重塑期间发生的Ca（2+）处理改变中起着关键作用。

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数字

**图1。**
两种功能不同的肌浆网钙²⁺储存在新鲜分离的动脉肌细胞中。A类：ryanodine（Ry）对咖啡因（Caf）和环硫腙酸（CPA）诱导的细胞溶质Ca的影响²⁺浓度（[Ca²⁺]_细胞周期)动脉平滑肌细胞（ASMC）中的瞬变。显示[Ca空间平均变化时间过程的代表性记录²⁺]_细胞周期在图中fura-2的圆圈所示的单元格中*Ea公司*（巴，25μm）。B类：显示CPA诱导的瞬态Ca的汇总数据²⁺在不进行Caf/Ry预处理[（−）Caf/Ry]的控制条件下释放，以及在1μM Ry[（+）Caf/Ry]存在下重复施用Caf（10 mM）耗尽Caf/Ry-敏感存储后释放(n个=83）。数值为平均值±SE。C类和F类：显示CPA对咖啡因诱导[Ca影响的代表性记录²⁺]_细胞周期存在外部钙的瞬态²⁺(C类)以及ATP和Ca诱导的[Ca²⁺]_细胞周期瞬态Ca²⁺-游离介质(F类). 32人获得了类似结果(C类)和29个其他单元格(F类)分离自8只大鼠肠系膜动脉。Caf（10μM）、Ry（1μM），CPA（10μM）、ATP（5μM）和Ca²⁺-在横杆指示的时间内使用游离培养基。D类：咖啡诱导钙的汇总数据²⁺在没有[（−）CPA]和存在10μM CPA[（+）CPA][的情况下的响应(n个= 32). 数值为平均值±SE**P（P）*与Caf诱导的Ca振幅相比<0.05²⁺未经CPA预处理的控制条件下的响应。一种假彩色钙²⁺图像(*欧洲银行*)显示休息状态[Ca²⁺]_细胞周期在新分离的ASMC中。在Ca的末尾²⁺实验中，相同的细胞被标记为α-actin(*Ec公司*).

**图2。**
静息[Ca的比较²⁺]_细胞周期，咖啡因诱导钙²⁺释放，咖啡诱导的存储操作钙²⁺新分离和原代培养的ASMC中Ry受体（RyRs）的进入（SOCE）和表达。A类和B类：显示[Ca时间进程的记录²⁺]_细胞周期培养7天的新鲜游离心肌细胞和ASMC的变化。Ca（10 mM）用于Ca²⁺-游离钙²⁺包含溶液。消除Ca的任何贡献²⁺通过电压门控Ca流入²⁺在所示记录前10分钟添加10μM硝苯地平，并在整个实验过程中保持。C类：显示休息状态的总结数据[Ca²⁺]_细胞周期（开杆），Caf诱导的瞬态Ca²⁺细胞外钙缺乏时释放²⁺（阴影条），以及[Ca的二次上升²⁺]_细胞周期当Ca²⁺在新鲜分离和原代培养的ASMC中添加回（实心棒）。休息[钙²⁺]_细胞周期数据来自333个单元格。咖啡诱导钙峰值²⁺研究了74个新鲜分离细胞和44个培养细胞的释放瞬态和SOCE；每个条对应于总共16只大鼠的数据。数值为平均值±SE**P（P）*<0.05 vs.休息[钙²⁺]_细胞周期在新分离的细胞中***P（P）*<0.001相对于Caf诱导的Ca的振幅²⁺释放新分离的心肌细胞。D类：细胞培养期间ASMC对Caf（10 mM）敏感性变化的时间进程。咖啡反应细胞在*第1天*,2,三,4、和7表示为各组细胞总数的百分比（66–88个细胞/组）。所有ASMC均根据中所示的协议进行测试A类和B类值为平均值±SE**P（P）*<0.001 vs.新分离的ASMC。*E–G公司*：RyR-I的Western blot分析(E类)，RyR-II(F类)和RyR-III(*G公司*)新鲜解离和原代培养的ASMCs中的蛋白质表达（20μg/泳道）。来自骨骼肌（SkM；0.25μg/车道）、心脏（0.25μg/m车道）和大脑（20μg/道路）的膜蛋白用作对照。RyR蛋白（～500 kDa）在左边.显示了典型的蛋白质斑点；在5个(E类), 6 (F类)、和6(*G公司*)免疫印迹。解离、新分离的ASMC；培养基，原代培养ASMC。

**图3。**
增强CPA诱导的钙²⁺原代培养ASMC的释放和SOCE。A类和B类：显示[Ca变化时间过程的代表性记录²⁺]_细胞周期在新鲜分离和培养的心肌细胞中。CPA（10μM）用于钙²⁺-游离钙²⁺-包含溶液。在显示记录前10分钟添加硝苯地平（10μM），并在整个实验过程中保持。C类：显示CPA诱导的瞬态Ca的汇总数据²⁺细胞外钙缺乏时的峰值²⁺（阴影条）和[Ca的二次上升²⁺]_细胞周期当Ca²⁺在新鲜分离和培养的ASMC中添加回（实心棒）。CPA诱导的Ca峰值²⁺对42个新鲜分离细胞和96个培养细胞的释放瞬态和SOCE进行了研究。数值为12个实验（1只大鼠/实验）的平均值±SE**P（P）*<0.001 vs.CPA诱导的钙振幅²⁺新分离心肌细胞的释放和SOCE。

**图4。**
ATP诱导钙的比较²⁺释放、SOCE和受体操作的Ca²⁺1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP）的进入（ROCE）和表达_三Rs）。A类和B类：显示[Ca时间进程的代表性记录²⁺]_细胞周期新鲜分离和培养的ASMC的变化。ATP（10μM）用于钙²⁺-游离钙²⁺-包含溶液。在显示记录前10分钟添加硝苯地平（10μM），并在整个实验过程中保持。C类：显示ATP诱导钙的汇总数据²⁺释放（阴影条）和Ca²⁺新分离和培养的ASMC内的内流（固体棒）。ATP诱导的Ca的峰值振幅²⁺钙缺乏和存在时的反应²⁺在22个新鲜分离细胞和25个培养细胞中进行了研究。数值为8个实验（1只大鼠/实验）的平均值±SE**P（P）*<0.001 vs.ATP诱导钙的振幅²⁺有无外源钙时新鲜游离心肌细胞的反应²⁺.D类,F类、和*G公司*：IP的Western blot分析_三R-I型(D类)，IP_三R-II型(F类)、和IP_三R-III型(*G公司*)新鲜分离和原代培养ASMC中的蛋白质表达。新鲜分离心肌细胞的膜蛋白（10μg/lane inD类; 40μg/车道F类和*G公司*)和原代培养的ASMC（10μg/lane inD类; 20μg/车道F类和*G公司*)加载并探测特定的反IP_三Rs抗体。显示了典型的Western印迹。大脑膜蛋白（2μg/车道D类和20μg/车道F类和*G公司*)用作对照。E类：数据标准化为GAPDH的量，并表示为8个Western blot（16只大鼠）的平均值±SE**P（P）*<0.001与IP_三新分离心肌细胞中R-I蛋白的表达。7年获得了类似结果(F类)和8(*G公司*)免疫印迹。

**图5。**
离子粘蛋白诱导的钙升高²⁺肌（内质网）Ca的释放、SOCE和增强表达²⁺-培养ASMC中的ATP酶（SERCA）2b。A类：显示[Ca时间进程的代表性记录²⁺]_细胞周期细胞外钙缺乏和存在时0.5μM离子霉素诱导的变化²⁺在新鲜解离和培养的ASMCs中。B类：显示离子粘蛋白诱导的瞬时钙的汇总数据²⁺细胞外钙缺乏时的峰值²⁺（阴影条）和SOCE（实心条）。数据为总共6只大鼠78个新鲜分离细胞和74个培养细胞的平均值±SE***P（P）*<0.001 vs.新分离的ASMC。C类和E类：新鲜分离和原代培养ASMC中SERCA2b和SERCA2a表达的Western blot分析。加载膜蛋白（5μg/lane）并用特异性抗体进行检测。显示了典型的Western印迹。D类和F类：数据标准化为GAPDH量，表示为5的平均值±SE(D类)和4(F类)免疫印迹（12只大鼠）**P（P）*<0.001与新鲜分离的细胞相比。

**图6。**
增殖ASMC中瞬时受体电位C（TRPC1、TRPC4和TRPC5）和基质相互作用分子1（STIM1）蛋白的增强表达。A类,C类,D类、和F类：TRPC1的蛋白质印迹分析(A类)，TRPC4(C类)，TRPC5(D类)和STIM1(F类)在新鲜分离和原代培养的ASMC中表达。膜蛋白（10μg/lane）被加载并用特异性抗体进行检测。显示了典型的Western印迹。B类,E类、和*G公司*：数据标准化为GAPDH的量，表示为9的平均值±SE(B类), 7 (E类)、和5(*G公司*)免疫印迹（18只大鼠）**P（P）*与新鲜解离的细胞相比，<0.001。在8个(C类)免疫印迹。

**图7。**
增殖ASMC中Orai蛋白的增强表达。Orai1的Western blot分析(A类)，奥莱2(B类)和Orai3(C类)在人主动脉匀浆（Homog；20μg/lane）和人培养主动脉细胞（Cult；20μg/mlane）中的表达。Jurkat全细胞裂解物（20μg/泳道）作为阳性对照。显示了典型的Western印迹。在4个(A类), 3 (B类)和3(C类)免疫印迹。

**图8。**
ROCE的增强与增殖ASMC中TRPC3和TRPC6蛋白的增强表达相关。A类：显示比率时间进程的代表性记录（F₃₄₀/F类₃₈₀)80μM 1-油酰基-2-乙酰基诱导的信号-锡-新鲜分离和培养的ASMC中的甘油（OAG）。细胞外钙²⁺被1 mM Ba取代²⁺在水平条指示的时间。硝苯地平（10μM）在所示记录前10分钟施用，并在整个实验期间保持。B类：总结数据显示OAG诱导的新分离的ROCE(n个=46）和培养的ASMC(n个=38）。数值为平均值±SE***P（P）*<0.001 vs.新分离的ASMC。每个条对应于总共8只大鼠的数据。C类和E类：新鲜分离和培养心肌细胞（10μg/lane）中TRPC3和TRPC6表达的Western blot分析。D类和F类：数据标准化为GAPDH的量，表示为6的平均值±SE(D类)和8(F类)免疫印迹（18只大鼠）**P（P）*<0.001与新鲜分离的细胞相比。

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