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.2008年7月；49(7):2927-35.
doi:10.1167/iovs.07-0709。

蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）-1B与c-Met受体的关联及对角膜上皮创伤愈合的调节

阿祖塞娜·卡卡祖（Azucena Kakazu） 1, 沙尔玛大师, 海迪·E·P·巴赞
附属公司

蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）-1B与c-Met受体的关联及对角膜上皮创伤愈合的调节

阿祖塞娜·卡卡祖（Azucena Kakazu）等。 投资眼科视觉科学. 2008年7月.

摘要

目的：本研究的目的是研究角膜创伤愈合过程中上皮细胞中蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的表达和活性，以及PTP如何调节c-Met受体的激活和受体的近端信号传导。

方法：轻轻刮伤兔角膜表面，使角膜缘上皮保持完整，损伤后1、2、3和7天收集上皮。在器官培养模型中，去除上皮细胞，用肝细胞生长因子（HGF）培养角膜，加入或不加入PTP抑制剂bpV（phen）、PI-3K抑制剂wortmannin和LY294002。用HGF刺激人角膜上皮细胞（HCE），并加入或不加入bpV（phen）。用Western blot分析总细胞裂解物、细胞溶质和膜组分。用特定底物测量PTP活性。PTP1B和SHP-2基因被干扰RNA（siRNA）敲除。

结果：PTP活性和表达在伤口愈合过程中增加。最丰富的是SHP-2、PTP1B和PTEN。HGF在30分钟内激活HCE细胞中的c-Met受体，2小时后下调。PTP的抑制增加了HGF促进伤口愈合、HGF激活c-Met的磷酸化及其下游信号PI-3K/Akt，但不增加ERK1/2或p70S6K。PTP1B和SHP-2与c-Met结合。部分c-Met与PTP1B在内质网中共定位。当c-Met受体失活时，PTP1B磷酸化增加，并且PTP1B基因敲除增加了c-Met激活。在受体激活期间，SHP-2磷酸化和与c-Met的结合更高，而SHP-2基因沉默降低了受体磷酸化。

结论：PTP活性的抑制通过激活参与伤口愈合的PI-3K/Akt信号来模拟HGF的作用。PTP1B和SHP-2与c-Met受体结合以控制其活性。虽然PTP1B的结合在c-Met活化减少时增加，并作为受体的负调节器，但SHP-2的结合和磷酸化增加与c-Met的最大刺激相一致，起到正调节器的作用。

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数字

图1
图1。PTP在“体内”上皮伤口愈合过程中的活性和表达
新西兰兔被轻轻刮伤角膜，角膜缘上皮保持完整。收集对照组和受伤兔的角膜上皮，并按照方法中的说明制备细胞液和膜组分。A） 在损伤前和损伤后48小时，用5µg蛋白质测量总PTP活性，如方法中所述。数值代表三个样品的平均±SD。*与对照组相比存在显著差异。B） 在损伤后1、2、3和7天采集样本，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量蛋白质，并用PTP抗体进行免疫印迹分析。作为细胞溶质部分的负荷控制，使用了一种35kDa蛋白，该蛋白与一些抗体杂交后出现在凝胶中，并且在愈合过程中不会改变其表达。在膜部分，磷酸酶KAP在损伤后1-7天内也没有变化。数据代表两个实验中的一个。
图2
图2。HGF刺激后c-Met的酪氨酸磷酸化
用指定浓度和时间的HGF处理HCE细胞，然后进行裂解。用Tyr免疫印迹全细胞裂解物1234和Tyr1235磷酸化c-Met抗体（p-c-Met）。以GAPDH作为凝胶负载控制对膜进行重新切割。将In（A）HCE细胞与不同浓度的HGF孵育15分钟，In（B）和（C）用40 ng/ml HGF刺激不同时间。D） 用bpV（phen）处理HCE细胞，用HGF刺激或不刺激HCE细胞15分钟，用p-c-Met进行免疫染色。Hoescht被用于核染色。实验重复了三次，结果相似。
图3
图3。PTP抑制对HGF刺激下游激酶的影响
A） 用40 ng/ml HGF刺激HCE细胞不同时间，细胞裂解液用p-Akt-1进行Western blot，然后用Akt-1抗体重新blot；p-p706SK后接p706SK和p-ERK1/2后接ERK1/2抗体。B） 用含或不含6或10µM bpV（phen）的HGF刺激HCE细胞。为了测定PI-3K的p85亚单位的磷酸化，首先用PY抗体对样品进行免疫沉淀，然后用p85进行免疫印迹。显示了三个典型实验之一的数据。
图4
图4。与PTP1B和SHP2的c-Met和磷酸酪氨酸含量结合
HCE细胞在40 ng/ml HGF的存在或不存在下培养不同时间，然后收集在裂解缓冲液中。用单克隆c-Met抗体（A和B）或PY单克隆抗体（A）免疫沉淀细胞裂解物（1mg），如方法所示。蛋白质通过4-12%梯度凝胶分离并转移到PVDF膜。用多克隆PTP1B抗体（A）或多克隆SHP-2和磷酸化多克隆p-SHP-2抗体（B）对膜进行免疫印迹。剥离膜，并用c-Met抗体重新制备。这些数据代表了三个类似实验中的一个。
图5
图5。PTP1B和SHP-2基因敲除对c-Met磷酸化的影响
用PTP1B、SHP-2或阴性对照siRNA转染HCE细胞。如方法所述，用HGF、4或6 M bpV（phen）或bpV（fen）加HGF处理细胞。（A） 用PTP1B和SHP-2抗体免疫印迹法检测转染和敲除表达的选择性。用p-C-Met抗体对转染PTP1B（B）或SHP-2（C）的细胞及其对照细胞进行免疫印迹，以显示C-Met的磷酸化是如何受到影响的。GAPDH被用作负荷控制。实验重复一次，结果相似。
图6
图6。PTP1B和c-Met在HCE细胞中的定位
按照使用PTP1B和c-Met抗体的方法中的描述，对细胞进行免疫荧光处理。PDI（蛋白质二硫键异构酶）抗体作为ER标记物。Hoescht被用来染色细胞核。A） 当叠加图片时，显示了PTP1B与ER标记的共放大。B） PTP1B与c-Met的联合定位。
图7
图7。bpV（phen）增加HGF刺激的上皮伤口愈合，PI-3K抑制剂可逆转这种愈合
角膜损伤后，在HGF（40 ng/ml）存在或不存在6µM bpV（phen）、200 nM沃特曼或20µM LY294002的无血清培养基中培养24小时。角膜用茜素红染色，并计算剩余的未覆盖面积。这些图片代表了每种情况下的角膜。每个治疗中，条形对应5-6个角膜*24小时时与对照组相比p<0.05，与HGF相比**p<0.05，与bpV（phen）+HGF（学生测试分析）相比***p<0.05。
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