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.2008年7月;118(7):2526-34.
doi:10.1172/JCI33293。

琥珀酸受体GPR91在小鼠和兔肾脏的高糖水平和肾素释放之间提供直接联系

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琥珀酸受体GPR91在小鼠和兔肾脏的高糖水平和肾素释放之间提供直接联系

伊尔迪科托马等。 临床研究杂志. 2008年7月.

摘要

糖尿病是发达国家终末期肾病最常见且增长最快的病因。早期糖尿病的典型特征包括肾素-血管紧张素系统(RAS)的激活,这可能导致高血压和肾组织损伤,但RAS激活的机制尚不清楚。在这里,我们确定了肾脏中的旁分泌信号通路,在该通路中,高水平的葡萄糖直接触发原高血压激素肾素的释放。在大鼠、小鼠和兔肾切片中观察到,信号级联涉及肾小球内皮中琥珀酸的局部积累和肾特异性G蛋白偶联代谢受体GPR91的激活。信号转导元件包括内皮细胞Ca2+、NO和前列腺素(PGE2)的产生及其对邻近肾素生成细胞的旁分泌作用。这种GPR91信号级联可能有助于调节肾功能,并通过肾脏超滤帮助清除代谢废物,还可能将代谢性疾病,如糖尿病或代谢综合征与RAS过度激活、系统性高血压和器官损伤联系起来。

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图1
图1。高血糖水平对JGA的直接和急性影响。
(A类B类)实时共聚焦荧光成像技术检测兔肾微灌注终末传入小动脉(AA)中肾素含量(奎那克林,绿色)和血管直径(细胞膜标记为R-18,红色),附带肾小球(G)。为了响应从5.5 mM(对照,A类)至25.5 mM(高糖水平,B类)JG细胞(JG)中大量肾素颗粒释放其荧光含量,传入小动脉内径(箭头)增大。比例尺:20μm。(C类)应用高糖水平(HG)30分钟内,奎那克林荧光正常降低(作为肾素释放的指标),传入小动脉直径增加。阻断NO合成酶(L-NAME;1 mM)和环氧合酶([I]吲哚美辛;50μM)抑制高糖水平的影响,表明NO和前列腺素分别参与其中。去除内皮细胞(内皮细胞)或浴葡萄糖没有效果,等摩尔甘露醇只引起轻微的肾素释放*P(P)< 0.01;n个=6个。
图2
图2。TCA循环中间产物和抑制剂对肾素释放的影响。
(A类)氟柠檬酸盐(F;100μM;在步骤2中阻断乌头酶)和丙二酸盐(MAL;1 mM;在第6步中阻断琥珀酸脱氢酶)对TCA循环和抑制位点的概述。(B类)TCA循环抑制剂对正常(未指示时为5.5 mM)、高糖(25.5 mM)或琥珀酸(SUCC,5 mM。C、 控件*P(P)<0.001,对照组与高糖组,高糖加琥珀酸盐、琥珀酸盐和丙二酸盐**P(P)<0.001丙二酸盐单独与丙二酸加高糖和丙二酸再加琥珀酸比较。n个=6个。(C类)琥珀酸和丙二酸对体外肾素释放的剂量依赖性影响。n个=每剂量6次测量。(D类)奎那克林荧光强度变化的代表性记录(肾素释放)在对照组和对高糖和琥珀酸水平的反应(黑线),以及高糖水平诱导的传入小动脉血管扩张的时间进程(灰线)。
图3
图3。琥珀酸在糖尿病肾脏组织和尿液中的积累。
酶分析和新鲜采集的尿液和全肾匀浆用于评估对照组的琥珀酸积累(n个=5)与糖尿病(DM;STZ治疗1周后;n个=6)GPR91 WT小鼠肾脏。每个样品测量三次并取平均值*P(P)<0.001对照组与糖尿病组。
图4
图4。高糖水平诱导肾素释放91加仑/分+/+91加仑/分–/–老鼠。
高葡萄糖水平(25.5mM)对肾素释放的影响,通过奎纳克林荧光的减少来测量。还显示了使用甘露醇进行高渗控制(数据与图1C相同)。C、 对照基线肾素释放。91加仑/分+/+(重量,n个=6)和91加仑/分–/–(KO,n个=4)使用小鼠*P(P)<0.001,对照组与高糖管腔组(兔子、老鼠)。
图5
图5。GPR91在GENC中的本地化。
(A类)代表性RT-PCR证明各种小鼠肾细胞类型中存在/不存在GPR91。C、 不含cDNA的对照混合物;WK,WT的全肾91加仑/分+/+或KO91加仑/分–/–老鼠。在中获得了相同的结果n个=6个不同的样品。JGC,产生肾素的JG细胞。(B类E类)大鼠肾脏GPR91蛋白的免疫组织化学定位。(B类)在血管内皮细胞、终末传入小动脉(Aff.art.)和肾小球中均发现强GPR91标记(红色)。肾小球的一个区域(用矩形表示)在C类D类用于高分辨率共定位研究。(C类)大鼠内皮细胞标记物RECA-1(绿色)的双重标记鉴定了肾小球内毛细血管环(cl)的内皮细胞。(D类)GPR91(红色)和RECA-1(绿色)图像的叠加显示了相同结构中两种蛋白质的共定位(黄色)。DIC背景与荧光合并显示肾小球形态。(E类)阴性对照,不使用GPR91一级抗体。细胞核是蓝色的。比例尺:10μm(B类E类). (F类)GENC高程[Ca2+]与基线水平(正常血糖[NG],5.5 mM)相比的水平,以应对高糖水平(25.5 mM)和TCA循环抑制剂和中间产物。琥珀酸盐,5 mM;丙二酸盐,1 mM;氟柠檬酸盐,100μM*P(P)与NG相比,<0.001;n个=9个。(G公司)高糖水平和琥珀酸诱导的GENCa升高的剂量反应关系2+水平;n个=6个。前/后0,荧光(F)归一化为基线(F0). (H(H))琥珀酸诱导[Ca的细胞和GPR91特异性2+]响应。HEK细胞用于生物传感器实验(见下文)*P(P)<0.001,与基线相比;n个=6个。细胞在盖玻片上生长到接近汇合处,并装载Ca2+敏感荧光染料fura-2和[Ca2+]使用基于试管的分光荧光计(Quantamaster-8;Photon Technology Inc.)进行测量。
图6
图6。血管内皮中的GPR91信号。
琥珀酸和GPR91诱导的内皮细胞溶质Ca2+[加利福尼亚州2+]使用微灌注小鼠传入小动脉连接的肾小球制剂和共焦荧光显微镜以及氟-4/呋喃红比率钙来研究信号传导和NO生成2+(A类)和DAF-FM成像(B类)分别为。箭头指向原位肾小球和传入小动脉内皮细胞。比例尺:20μm。(C类)高糖(25.5mM)和琥珀酸(5mM)诱导内皮细胞[Ca2+]WT中NO的生成91加仑/分+/+或KO91加仑/分–/–肾组织*P(P)<0.05,重量(+/+)与KO相比(–/–);n个=6个。(D类)琥珀酸诱导前列腺素E升高的剂量反应关系2用PGE测量培养GENC的产生和释放2生物传感器。特殊设计的生物传感器细胞,HEK293细胞,表达Ca2+-耦合PGE2受体EP1装载有fluo-4并定位在培养的GENCs旁边。琥珀酸盐对GENC PGE的影响2根据生物传感器细胞钙测定产量2+信号,自PGE起2-结合这些生物传感器细胞产生钙2+荧光成像检测反应。环氧化酶抑制剂吲哚美辛(50μM)和EP1受体阻滞剂SC-51322(10μM)在5-mM琥珀酸盐存在下均作为PGE的阴性对照2特异性。显示HEK293-EP1生物传感器细胞fluo-4强度的标准化变化,并用作PGE的指标2释放。n个=每剂量6。
图7
图7。肾素颗粒含量91加仑/分+/+91加仑/分–/–小鼠体内试验。
(A类B类)非糖尿病患者JGA肾素含量(绿色)的典型多光子荧光图像(A类B类)和糖尿病(C类D类)91加仑/分+/+(A类C类)和91加仑/分–/–(B类D类)小鼠肾脏。血管内间隙(血浆)用70-kDa右旋糖酐-罗丹明结合物(红色)标记。比例尺:20μm。(E类)对照组和1型糖尿病STZ模型(STZ糖尿病;DM)中JGA肾素含量的变化总结91加仑/分+/+91加仑/分–/–老鼠。根据奎那克林荧光面积(μm)计算JGA肾素含量2).*P(P)<0.05,C与DM相比91加仑/分+/+;ΧP(P)<0.05,C91加仑/分+/+与C相比91加仑/分–/–;#P(P)<0.05,DM91加仑/分+/+与DM相比91加仑/分–/–(n个=4个)。(F类)使用对照组和STZ糖尿病患者的肾素免疫印迹(绿色)91加仑/分+/+91加仑/分–/–小鼠整个肾脏。每组显示四个样本。β-actin(红色)作为负荷控制。(G公司)基于肾素免疫印迹密度测定的全肾肾素含量变化总结*P(P)<0.05 C与DM91加仑/分+/+;#P(P)<0.05 DM91加仑/分+/+与DM相比GPR91型–/–(n个=4个)。
图8
图8。对照组和STZ糖尿病患者全肾和血清肾素原含量的变化91加仑/分+/+91加仑/分–/–老鼠。
在全肾匀浆和血清中测量肾素原,作为用荧光肾素酶论文测量胰蛋白酶激活肾素原前后肾素活性的差异。与年龄匹配的非糖尿病对照动物相比,糖尿病动物的整个肾组织和血浆样本中的原肾素含量显著增加。糖尿病患者91加仑/分–/–动物的肾脏或血清前肾素含量没有变化*P(P)<0.05,C vs.DM91加仑/分+/+;#P(P)<0.05,DM91加仑/分+/+与DM相比91加仑/分–/–(n个=4个)。

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引用人

工具书类

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