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.2008年5月23日；4（5）：e1000079。
doi:10.1371/journal.pgen.1000079。

转录激活物Hnf1alpha靶向缺失改变其基因组靶点的亚核定位

雷尼·F·卢科 1, Miguel A大师, 尼古拉斯·萨多尼, 丹尼尔·辛克, 豪尔赫·费雷尔
附属公司

转录激活物Hnf1alpha靶向缺失改变其基因组靶点的亚核定位

雷尼·F·卢科等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

DNA结合转录激活物在基因选择调控中起着核心作用。在某种程度上，这是通过靶向组蛋白尾部的局部共价修饰来介导的。转录调控也与细胞核内基因的定位有关。我们现在已经研究了转录激活物在调节靶基因定位中的作用。这项研究是用从缺乏Hnf1alpha（人类单基因糖尿病（MODY3）中最常见突变基因编码的激活物）的小鼠中新分离的原代β细胞和肝细胞进行的。我们发现，在Hnf1a-/-细胞中，非活性内源性Hnf1alpha靶基因显示出增加的三甲基组蛋白H3-Lys27和减少的甲基化H3-Llys4。Hnf1a-/-细胞中的非活性Hnf1alpha-靶点也优先位于富含三甲基化H3-Lys27的外周亚核区域，而野生型细胞中的活性靶点位于富含甲基化H3-Lys4和RNA聚合酶II的更中央区域。我们证明，这种差异定位涉及靶染色质的去凝聚，并表明它是空间限制性的，而不是Hnf1a缺陷细胞核组织中非特异性变化的反映。因此，这项研究提供了遗传学证据，证明单个转录激活物可以影响其内源性基因组靶点在原代细胞中的亚核位置，并将局部染色质结构中的激活物依赖性变化与基因组的空间组织联系起来。我们还发现了人类转录因子疾病模型中亚核基因定位的缺陷。

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图1
图1。非活动Hnf1α中的目标Hnf1a型−/−细胞表现出H3-Lys27me3的局部富集，H3-Lys4me2降低，DNAse I敏感性降低。
（A） 组织特异性RNA表达Hnf1α目标(Afm、Cyp2j5、Pah、Kif12)和控制基因(Tbp，实际值b)英寸Hnf1a型+/+和Hnf1a型−/−肝脏和胰岛。（B） 组织特异性靶点和对照基因启动子区Hnf1α占据的ChIP分析(纳克)英寸Hnf1a型+/+和Hnf1a型−/−肝细胞(Afm、Cyp2j5和Pah，分别为黑色和白色条）和MIN6β细胞(基辅12，黑色条）。结果标准化为Tbp公司浓缩*相对于纳诺。Hnf1α靶点和控制基因组蛋白修饰的（C–H）ChIP分析Hnf1a型+/+和Hnf1a型−/−肝细胞。对所有基因的5′侧翼区域进行了分析，但D、G除外，其中Cyp2j5号机组对轨迹进行了分析。蓝色水平线表示扩增子位置，灰色框表示外显子，红色线表示计算预测的高亲和力HNF1结合位点，箭头表示转录起始位点。图表显示了3个独立实验中抗甲基特异性H3与抗H3抗体的输入免疫沉淀百分比的平均值±SEM。黑色条表示Hnf1a型+/+和白色条Hnf1a型−/−肝细胞*相对于Hnf1a型+/+肝细胞。（I） 一般脱氧核糖核酸酶敏感性Cyp2j5号机组.代表性PCR分析Cyp2j5号机组和Actb公司消化后的5′侧翼和编码序列区域Hnf1a型+/+和Hnf1a型−/−细胞核中DNAse I含量增加Hnf1a型−/−核Cyp2j5号机组区域，但不在Actb公司控制轨迹。
图2
图2。甲基化组蛋白H3标记呈现非随机亚核分布。
（A） 与间期野生型肝细胞核中的RNA聚合酶II（绿色）相比，对富含H3-Lys4me2、H3-Llys9me3和H3-Lys27me3（红色）的结构域进行双重免疫荧光共聚焦分析。相邻的维恩图显示超过75的信号的共定位百分比（20个核的平均值±SEM）第个野生型细胞核中核信号强度的百分位数。（B） 肝细胞中RNA聚合酶II（红色）、层粘连蛋白A/C（绿色）和H3-Lys4me2或H3-Lys27me3（蓝色）的三重免疫荧光。下面的插图显示了放大倍率较高的外周核节段。（C） RNA聚合酶II、H3-Lys4me2或H3-Lys27me3核分布的侵蚀分析。细胞核被细分为5个同心区，并使用非阈值图像测定每个表位的总核荧光强度。图表显示了在每个区域观察到的总核荧光强度的百分比（平均值±SEM）。这些值被归一化为不同区域所占的相对核面积，因此，如果百分比在无偏分布的情况下符合预期，则获得值1。每个病例至少分析20个细胞核。通过方差分析获得3个表位中每个表位的5个区域之间的比较显著性值。
图3
图3。依赖Hnf1αCyp2j5号机组活性与RNA聚合酶II和组蛋白代码域的差异定位相关。
（A–D）典型共焦免疫-FISH分析Hnf1a型+/+和Hnf1a型−/−肝细胞Cyp2j5号机组带有RNA聚合酶II（RNA Pol II，绿色）和H3-Lys4me2（A，B）或H3-Lys27me3（C，D）（蓝色）的位点（红色）。框架区域包含Cyp2j5号机组每个面板右侧的FISH信号以高倍放大显示，省略了蓝色或绿色通道（E–N）Cyp2j5号机组（J–N）和赖氨酸9控制（E-I）基因座Hnf1a型+/+和Hnf1a型−/−肝细胞。在每种情况下，在70-200个FISH信号下测量组蛋白标记和RNA聚合酶II的非阈值荧光强度，每个值除以同一通道中的核中值强度。因此，这些图表描绘了这样的平均值归一化信号数值±SEM，但I、N中的数值除外，该数值表示计算出的每个等位基因的H3-Lys27me3/RNA聚合酶II比率（mK27/Pol II）的平均值±SEM。（O–P）分类Cyp2j5号机组（P） 和赖氨酸9根据RNA聚合酶II（RNA Pol II）和H3-Lys27me3（K27me3）同时富集（+）或非富集（−），将控制（O）等位基因分为4类Hnf1a型+/+（黑色条）和Hnf1a型−/−（白色条）肝细胞。根据信号强度是否超过核信号的第75百分位，将每个等位基因分为富集（+）或非富集（−）。其他阈值（如核中值）产生了相对重要的结果（见正文）。结果表示为每个基因型的所有等位基因的%*相对于Hnf1a型+/+根据情况，使用Mann-Whitney或Fisher精确测试。
图4
图4。Hnf1α决定其靶基因座的径向核位置。
DNA-FISH的径向定位腐蚀分析Ly9型控制基因座（A，C）和Hnf1α依赖基因座Cyp2j5号机组（B） 和基辅12（D） 英寸Hnf1a型+/+（黑色条）和Hnf1a型−/−（白色条）肝细胞（A，B）和胰岛细胞（C，D）。将细胞核分为5个同心区，并针对每个基因座和基因型确定每个区中存在的FISH信号的百分比。该图描述了平均值±SEM*相对于Hnf1a型+/+细胞。
图5
图5。依赖于Hnf1α的重新定位的空间分辨率。
（A） 相邻基因座的双色DNA FISH检测Cyp2j5号机组（红色）和68H9（绿色）英寸Hnf1a型+/+肝细胞。（B） 位于着丝粒（12L1和263F12）和端粒（68H9和114C9）的BAC与Cyp2j5号机组.该区域中的Hnf1α依赖基因以红色示意图绘制。注意，尚未将剪接转录物映射到BACs 68H9和114C9所包含的区域。（C–G）根据RNA聚合酶II（RNA Pol II）和H3-Lys27me3（K27me3）同时富集（+）或非富集（−），将12L1（C）、263F12（D）、Cyp2j5（E）、68H9（F）和114C9（G）等位基因分为4类Hnf1a型+/+（黑色条）和Hnf1a型−/−（白色条）肝细胞，如图3O–P所示。（H–L）所示BAC克隆FISH信号之间距离的比较Hnf1a型+/+和Hnf1a型−/−肝细胞。对于每次比较，上部面板显示了平均±SEM焦点间距离（信号中心到中心），单位为µm，显著性值通过Mann-Whitney检验计算得出。下部面板显示了非重叠等位基因的百分比，定义为信号中心距离超过0.4µm的等位基因，其显著性值通过Fisher精确检验进行评估*p<0.05，**p<0.01相对于Hnf1a型+/+细胞。每个病例分析了100多个细胞核。
图6
图6。摘要模型。Hnf1a型−/−.
在缺乏Hnf1α的情况下，靶核小体表现出增加的三甲基化H3-Lys27，并且更有可能位于外周核结构域中，其浓缩染色质富含甲基化H3-Lys27。Hnf1a型+/+：在野生型细胞中，Hnf1α结合招募复合物，导致位点特异性组蛋白乙酰化、H3-Lys4甲基化和染色质重塑，同时阻止H3-Llys27的三甲基化。这种染色质结构与转录活性的重定位有关，更集中的核亚区富含RNA聚合酶II和H3-Lys4me2。我们认为激活剂依赖的局部染色质变化可能有助于基因定位。
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