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.2008年5月19日；181(4):667-81.
doi:10.1083/jcb.200711058。

肌纤维的完整性取决于通过不同的plectin亚型靶向Z盘和共基质的结蛋白网络

帕特里克·科尼奇尼 1, 彼得·富克斯, 齐格弗里德·雷佩特, Wolfram S Kunz公司, 阿尼科·泽尔德, 伊姆加德·菲舍尔, 丹尼斯·保林, 罗尔夫·施罗德, 格哈德·威切
附属公司

肌纤维的完整性取决于通过不同的plectin亚型靶向Z盘和共基质的结蛋白网络

帕特里克·科尼奇尼等。 J细胞生物学. .

摘要

补体是一种500-kD的细胞连接蛋白，其功能失调会导致皮肤起泡和肌营养不良。通过对小鼠进行条件基因靶向研究，我们发现，plectin缺乏会导致横纹肌进行性退行性改变，包括中间丝（IF）网络的聚集和部分丢失，收缩器从肌膜上脱落，肌纤维-间期细胞构筑发生深刻变化，线粒体数量和功能下降。对新生成的plectin异构体特异性敲除小鼠模型的分析表明，IF聚集体在不同的细胞质隔室中积累，这取决于缺失的异构体。我们的数据表明，肌肉中表达的两种主要的plectin亚型，plectin 1d和1f，通过特异性靶向结蛋白IFs并将其连接到Z盘和共基质来整合纤维，而plectin bb则建立了与线粒体的连接。此外，Z盘和共聚异构体连接的破坏导致大疱性表皮松解症伴肌营养不良的病理状态。我们的研究结果确立了肌动蛋白是肌纤维中结蛋白IFs的主要组织者，并为了解与结蛋白和结蛋白相关的肌营养不良提供了新的见解。

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数字

图1。
图1。
cKO-ple小鼠病理改变的发生和进展依赖于肌肉类型。（A） 6月龄f-ple和cKO-ple小鼠比目鱼肌的重量统计分析(n个= 14). 此外，还应注意cKO-ple与f-ple样本相比的苍白外观。（B） 8周龄（H&E）和6月龄小鼠（天狼星红）的f-ple和cKO-ple比目鱼的冰冻切片。在cKO-ple样品中，注意到肌乳头下致密结构（插图），以及大量坏死（1）、中央有核（2）、分裂（3）和肥大（4）纤维。天狼星红染色还显示cKO-ple样本中存在广泛的纤维化。方框区域表示以插图形式详细显示的代表性光纤。（C） 电子显微照片显示肌膜从cKO-ple纤维（比目鱼肌和膈肌）内部分离，并使用甲苯胺蓝染色的比目鱼肌肉切片量化受影响的纤维。（D） 3个月久坐和运动的cKO-ple室友中CNF的百分比(n个= 15). （E） 比目鱼鱼CNF百分比图(n个=16），老挝国家电力公司(n个=17）和隔膜(n个=11）的f-ple和cKO-ple小鼠。（F） 16个月龄cKO-ple小鼠的心脏切片用H&E或天狼星红染色。注意结缔组织形成增加（箭头），这表明心肌细胞变性。（G） 久坐状态（8周龄；n个=10）或行使（6个月；n个=4）f-ple和cKO-ple小鼠。条形图显示平均值±SEM.*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。棒材：（B和F）100μm；（C） 2微米。
图2。
图2。
缺乏补体蛋白会导致IFs聚集和收缩器紊乱。（A） Soleus f-ple（A和c）和cKO-ple（b和d）切片双重免疫标记plectin和结蛋白（A和b），或仅染色结蛋白（c和d）。注意，结蛋白聚集在纤维内部（d，箭头），并沿着肌膜（d，箭头）在凝集素阴性纤维中积累。面板b中的双头箭头表示具有保留结蛋白阳性图案的补体阳性纤维。（B） 如图所示，使用蛋白抗体对f-ple（a、c和e）和cKO-ple（B、d和f）心脏切片进行免疫标记。在cKO-ple心肌细胞中，注意结蛋白（b，箭头）和错位Z盘（f，插图）的聚集，以及看似保留的插入盘结构（双箭头）。（C） f-ple（a和C）和cKO-ple（b和d）比目鱼肌纵切面（a和b）和EDL横切面（C和d）的蛋白质染色如图所示。星号表示光纤内部没有IF。面板b中的双头箭头表示保留IF图案的CNF。面板c和d中的虚线框表示插图中放大的区域。（D） 对来自f-ple（a和c）和cKO-ple（b和D）EDL的梳理纤维进行免疫荧光显微镜观察，发现cKO-ple小鼠中存在大量纵向结蛋白聚集体（b）和错位的α-肌动蛋白阳性共基质（D，插图）。在f-ple costameres（c，插图）的情况下未观察到错位。还请注意结蛋白IFs与f-ple核（a，插图）的密切联系，但它们与cKO-ple核（b，插图）分离。虚线框表示插图中放大的区域。棒材，20μm。
图3。
图3。
干扰素的丢失和缺乏plectin的肌肉的共栖晶格的深刻变化。（A） 如图所示，来自4-mo-old f-ple和cKO-ple小鼠的梳理EDL纤维的代表区域被蛋白质染色。箭头和箭头分别表示Z盘对齐和垂直纵向结蛋白阳性共晶结构。在f-ple纤维中，注意结蛋白IFs与合胞蛋白、联会蛋白、细胞角蛋白8、β-DG、肌营养不良蛋白、nNOS和联会滋养蛋白共定位，但与小窝蛋白3没有共定位。在cKO-ple纤维中，所有共聚体标记蛋白都显示出深刻变化的定位模式。棒材，5μm。（B和C）对每个基因型（B）三只6月龄小鼠的腓肠肌裂解物和至少三次凝胶电泳的微粒体部分进行定量免疫印迹分析（C）。负荷标准化为总蛋白质含量（考马斯染色凝胶）。条形图表示平均值±SEM。
图4。
图4。
凝集素缺乏导致线粒体网络破坏，同时伴有线粒体减少和功能障碍。（A） 比目鱼鱼和EDL的横截面进行SDH染色。插图显示了典型纤维的特写（盒装）。图a和图b中的箭头表示富含线粒体的纤维。（B和C）比目鱼肌和EDL横截面的免疫荧光显微镜，对结蛋白和线粒体进行免疫染色（B），对比目鱼鱼肌纵截面进行plectin和线粒体标记（C）。注意f-ple纤维（C，a，箭头）中plectin和线粒体沿Z盘的共定位，以及cKO-ple和des中厚的纵向线粒体聚集体−/−纤维（C、b和C）。（D） 电子显微镜显示线粒体（a和b）的细胞质聚集体、线粒体与Z盘的罕见结合以及Z盘错位（a和c）；图b和c是图a中方框区域的放大图。（E）f-ple和cKO-ple腓肠肌和EDL裂解物的定量免疫印迹。左图所示数据来自腓肠肌；条形图（右侧）表示腓肠肌和EDL相对于肌肉的汇总数据（100%）。α-肌动蛋白作为负载对照。每个基因型至少收集五只小鼠的数据。数值代表平均值±SEM。（F）线粒体呼吸活动的生化分析。在8周龄小鼠的f-ple和cKO-ple soleus中测量柠檬酸合成酶、复合物I（NADH–Q1）和复合物IV（COX）(n个= 12). 显示了平均值（U/g湿重）±SEM。*，P<0.05；***，P<0.001。棒材：（A）50μm；（B和C）20μm；（D） 2微米。
图5。
图5。
1岁cKO-ple，ple1d的病理改变比较−/−、和des−/−老鼠。（A） 比目鱼肌和膈肌的H&E分析。显示萎缩纤维（1）、中央有核纤维（2）、肥大纤维（3）和坏死纤维（4）。棒材，50μm。（B和C）柱状图，显示比目鱼肌（B）和横膈膜（C）中对照和突变纤维的CSA。（D和E）每个基因型至少三只小鼠比目鱼肌纤维（D）和CNF（E）总数的量化。数据表示平均值±SEM.*，P<0.05；**，P<0.01。
图6。
图6。
结蛋白IFs的凝集素亚型依赖性组织。（A） 用46号抗血清对比目鱼肌纵切面进行免疫染色。在ple1中观察到条纹状的plectin图案−/−，请参阅第1页−/−、和des−/−样本；在ple1d中−/−和ple1d−/−/des（目标）−/−样本，这样的模式缺失。褶皱中的箭头和箭头−/−面板分别代表plectin阳性肌膜和内部点状结构。请注意，ple1d的内部−/−/des（目标）−/−纤维完全没有plectin阳性信号。（B） 如A所示，对EDL的撕裂纤维进行免疫染色。注意，与纵向核周结构相关的信号在ple1中减少−/−与ple1b相比−/−纤维（箭头）。此外，服装的整体结构也出现了局部紊乱−/−和des−/−示例（箭头）。（C） Ple1d公司−/−比目鱼肌切片双重免疫标记plectin和结蛋白（a）、结蛋白和线粒体（b），或染色SDH（c）。插图显示了放大后的方框区域中线粒体的肌膜下聚集。图d中的电子显微照片显示，肌下膜区扩大的线粒体内部溶解（箭头所示）。（D） Ple1d公司−/−EDL横截面双免疫标记结蛋白和联会蛋白，显示纤维内部和大部分未受影响的肌膜区域的聚集物（另见插图，方框区域的放大视图）。（E） 梳理褶的免疫荧光显微镜−/−使用所示抗体的纤维（EDL）。在面板a和面板b中，请注意分别未受影响的plectin 1和1f的核周和共腔模式。面板c和c′表示一根光纤的连续共焦截面。该光纤的光学横截面（标记为1）如面板c′中的插图所示，水平线指示面板c和c′中所示平面的位置。请注意，拼板c中的共聚物图案缺乏聚集物，而结蛋白聚集在拼板c′中的纤维内部（箭头所示）。棒材：（A；B；C、A和B；D；和E）20μm；（C，C）50微米；（C，d）2μm。（F） 不同小鼠突变体腓肠肌裂解物中plectin的定量免疫印迹。与WT样品（100%）相关的数据表示三个实验的平均值±SEM。
图7。
图7。
凝集素1d整合收缩器，而凝集素1 f将结蛋白IF锚定在肌膜上。（A） 腓肠肌WT，ple1d的定量免疫印迹−/−，个−/−、和ple1d−/−/des（目标）−/−使用所示蛋白的抗体裂解产物。ple1d的带强度−/−根据每个基因型三只小鼠的WT信号对样本进行密度测定。（B） 4个月褶皱梳理纤维（EDL）的免疫荧光显微镜观察−/−老鼠露出一个基本上未受影响的共栖格子。（C） WT和ple1d的纵截面−/−比目鱼肌结蛋白和α-肌动蛋白双重免疫染色，线粒体荧光显示。注：（1）结蛋白染色的肌膜与肌动蛋白阳性的细胞骨架分离，（2）肌膜与收缩器之间的空间充满自荧光绿色线粒体（箭头），（3）结蛋白IFs和线粒体在α-肌动蛋白染色的肌原纤维（箭头）之间积聚。（D） 比目鱼肌的电子显微照片，显示一个ple1d的肌膜分离（星号）−/−纤维；如图1 C所示，对显示分离的纤维进行定量。（E）WT，ple1d微粒体的免疫印迹−/−，和ple1d−/−/des（目标）−/−肌肉和微粒体中α-肌动蛋白相对于WT信号的定量（100%）。A和E中的考马斯染色凝胶用作负荷控制。图表表示平均值±SEM。棒材：（B）5μm；（C） 20微米；（D） 2微米。
图8。
图8。
描述骨骼肌中表达的四种主要补体亚型的不同锚定功能的方案。Plectin 1d、1f、1b和1分别将结蛋白IFs与Z盘、共基质（DGC）、线粒体和外核/ER膜系统连接。
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参考文献

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