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.2008年5月15日；111(10):5152-62.
doi:10.11182/血液-2007-10-116889。 Epub 2008年3月19日。

BH3-only蛋白Noxa、Bmf和Bim是三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞死亡所必需的

阿莱乔·A·莫拉莱斯 1, 迪莉娅·古特曼, 开尔文·P·李, 劳伦斯·博伊西
附属机构

BH3-only蛋白Noxa、Bmf和Bim是三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞死亡所必需的

阿莱乔·A·莫拉莱斯等。 血液. .

摘要

使用三氧化二砷（ATO）治疗多发性骨髓瘤（MM）得到了临床前研究和一些第二阶段研究的支持，但ATO的确切作用机制尚未完全阐明。我们使用基因表达谱来确定ATO对4MM细胞系凋亡相关基因的调控，然后重点研究Bcl-2家族基因。ATO诱导3种促凋亡BH3-only蛋白（Noxa、Bmf和Puma）上调，2种抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-X（L）下调。免疫共沉淀表明，添加ATO后6小时内，Noxa和Puma结合Mcl-1释放Bak和Bim。Bak和Bim也从Bcl-X（L）中释放。沉默Bmf、Noxa和Bim可显著保护细胞免受ATO诱导的凋亡，而沉默Puma则无作用。与Noxa抑制Mcl-1的作用一致，Bad-mimetic ABT-737与ATO协同杀死2 MM株。最后，通过GSH耗竭增强Noxa表达，并通过增加细胞中的GSH水平抑制Noxa的表达。了解BH3-only蛋白反应的模式有助于合理设计含砷方案。

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数字

图1
图1
ATO诱导4株人骨髓瘤细胞凋亡。U266、MM.1s、8226/S和KMS11用0、0.5、1、2和4μM ATO处理24、48和72小时。膜联蛋白-V-FITC/PI染色后，通过流式细胞术测定细胞活力。绘制了对照生存率百分比（%）与ATO浓度的关系图。显示了每个时间点的图形。数据以3个独立实验的平均值（±SD）表示。
图2
图2
ATO诱导Bcl-2家族变化的基因表达谱。用2μM ATO处理U266、MM.1s、8226/S和KMS11细胞株6、24和48小时。获得总RNA，并在Affymetrix Hu133 2.0 Plus芯片上探测cRNA。信号强度作为基因表达。计算每个探针组在6、24和48小时时与基线基因表达的比率，并获得基因的平均比率。使用生物信息学程序Cluster和TreeView对Bcl-2家族成员基因进行聚类。底部的条表示折叠更改的比例。
图3
图3
上调Bmf、Noxa和Puma，下调Mcl-1和Bcl-XL（左）由ATO负责。U266、MM.1s、8226/S和KMS11用2μM ATO处理6、24和48小时。（A） 获得富含线粒体的组分，并通过Western blot检测Bmf的表达。用兔抗COX IV多克隆抗体重制膜以测定负荷。（B） ATO处理细胞总蛋白裂解物的Western blot分析。用Noxa、Puma、Bim、Mcl-1、Bcl-X的特异性抗体检测膜L（左）和肌动蛋白。（C） 如“亚细胞分馏”所示，未经处理和24小时ATO处理的MM.1s和KMS11细胞获得了细胞溶胶和重膜组分。肌动蛋白和COX IV用作组分纯度的指标。
图4
图4
促凋亡蛋白与Mcl-1、Bcl-X的协同免疫沉淀L（左）和Bcl-2。用2μM ATO处理MM.1s和KMS11细胞株0、6和24小时。使用2%CHAPS缓冲液制备蛋白裂解物。（A） Mcl-1，（B）Bcl-XL（左）和（C）Bcl-2蛋白用单克隆抗体免疫沉淀。用Bak、Bax、Noxa、Bim、Puma、Mcl-1、Bcl-X的特异性抗体通过Western blot检测共免疫沉淀蛋白L（左）和Bcl-2。面板两端的分隔带代表IP的输入。该通道包含10%的输入，但凝胶中只装载了60%的免疫沉淀蛋白。所示的所有波段均来自相同的实验和相同的胶片曝光。
图5
图5
BH3-only蛋白Bmf、Noxa和Bim沉默保护细胞免受ATO诱导的凋亡。用siBmf、siNoxa、siBim、siPuma和siBid（SmartPool；DHARMACON RNA Technologies）对MM.1s和KMS11细胞系进行电穿孔。非靶向siRNA（si（-））池用作阴性对照。16小时后，用2μM ATO处理细胞6小时和24小时，用于实时PCR或Western印迹分析，并处理24小时和48小时，用于ATO诱导的细胞凋亡分析。（A） 获得了si（-）对照和经ATO处理的siBmf样品的总RNA。实时PCR检测Bmf转录表达。Bmf相对表达是指相对于GAPDH转录表达的Bmf转录表达。（B） 获得si（-）对照、siNoxa-、siBim-、siPuma-和siBid-转染细胞的蛋白裂解物，并在ATO处理后6和24小时通过Western blot测定沉默。（C） 用2μM ATO处理siRNA电穿孔细胞24和48小时。通过annexin-V–FITC/PI染色评估存活率。绘制对照组（未经处理、转染的）存活率百分比（%）与时间（小时）的关系。数据分别表示为MM.1s和KMS11的4个和5个独立实验的平均值（±SD）。t吨试验用于比较样品、si（-）和实验组合之间的差异，除非另有说明，置信区间为95%。ND表示无差异*P（P）< .05; **P（P）< .01; ***P（P）< .001.
图6
图6
Bcl-2/Bcl-X的作用L（左）ATO抑制剂诱导细胞凋亡。用2μM ATO和指示浓度的ABT-737或活性较低的对映体（-）ABT处理MM.1s和KMS11细胞系24小时。通过annexin-V–FITC/PI染色测定存活率。绘制凋亡百分比（%）与ABT-737浓度的关系图。数据表示为5个独立实验的平均值（±SD）。t吨试验用于比较预期加性效应和实际共处理结果之间的差异，置信区间为95%。ND表示无差异*P（P）< .05; **P（P）< .01; ***P（P）<.001。
图7
图7
BSO使细胞对ATO敏感，并增强BH3-only蛋白Noxa的上调。（A） 将1μM ATO作为单一试剂或与BSO（100μM）或NAC（10 MM）联合处理MM.1s和KMS11细胞48小时。通过annexin-V–FITC/PI染色评估存活率。数据以3个独立实验的平均值（±SD）表示。（B） MM.1s和KMS11细胞处理24小时。蛋白质表达通过Western blot检测。用针对Noxa、Puma、Bim、Mcl-1、Bcl-X的特异性抗体重新处理膜L（左）和肌动蛋白。（C） 将2μM ATO作为单一试剂或与BSO和/或NAC联合处理KMS11细胞24和48小时。通过annexin-V–FITC/PI染色评估存活率。数据以4个独立实验的平均值（±SD）表示。Western blot检测Noxa的表达。t吨除非另有说明，试验用于比较样品、ATO和试验组合之间的差异，置信区间为95%。ND表示无差异*P（P）< .05; **P（P）<.01***P（P）< .001.
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