Mitochondrial proteomics of the retinal pigment epithelium at progressive stages of age-related macular degeneration

doi:10.1167/iovs.07-1352

.2008年7月；49(7):2848-55.

doi:10.1167/iovs.07-1352。 Epub 2008年3月14日。

年龄相关性黄斑变性进行期视网膜色素上皮线粒体蛋白质组学研究

柯蒂斯·诺德加德¹, 巴巴鲁·P·卡鲁纳达尔马, 肖峰, 蒂莫西·沃尔森, 黛博拉·费林顿

附属公司

PMID： 18344451
预防性维修识别码：项目经理4397576
内政部： 10.1167/iovs.07-1352

年龄相关性黄斑变性进行期视网膜色素上皮线粒体蛋白质组学研究

柯蒂斯·诺德加德等。投资眼科视觉科学. 2008年7月.

.2008年7月；49(7):2848-55.

doi:10.1167/iovs.07-1352。 Epub 2008年3月14日。

作者

柯蒂斯·诺德加德¹, 巴巴鲁·P·卡鲁纳达尔马, 肖峰, 蒂莫西·沃尔森, 黛博拉·费林顿

附属

¹美国明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏打大学眼科。

PMID： 18344451
预防性维修识别码：项目经理4397576
内政部： 10.1167/iovs.07-1352

摘要

目的：年龄相关性黄斑变性（AMD）是65岁以上人群视力下降的主要原因。视网膜色素上皮（RPE）是一种单层，为上覆的光感受器提供代谢支持，即使在视力丧失之前的AMD早期阶段，组织病理学变化也会变得明显。在之前的全球RPE蛋白质组分析中，发现了与AMD相关的几个线粒体蛋白质含量的变化。在本研究中，分析了用明尼苏达分级系统（MGS）分级的人供体RPE中分离的线粒体亚蛋白组。

方法：根据AMD的临床特征，将人类供体眼库眼分为四个进展期（MGS 1-4）之一。分离RPE后，根据电荷和质量用双向凝胶电泳分离线粒体蛋白。比较四个MGS阶段的蛋白点密度。从MGS阶段发生显著变化的斑点中提取肽，并使用质谱法进行分析，以鉴定蛋白质。

结果：Western blot分析证实线粒体在MGS阶段之间持续富集。随着MGS分期的增加，8个点的密度显著增加或减少。这些斑点被鉴定为α-、β-和δ-ATP合成酶亚单位、细胞色素c氧化酶复合物的VIb亚单位、丝裂原、mtHsp70和线粒体翻译因子Tu。

结论：结果与线粒体功能障碍与AMD相关的假设相一致，并进一步提示了涉及线粒体翻译改变、核编码蛋白输入和ATP合成酶活性的特定病理生理机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。MGS分期间供者年龄的散点图比较**
水平条表示各组的平均年龄。MGS 4供体的年龄明显大于任何其他类型的供体（单因素方差分析，p＜0.005和Tukey Kramer事后检验）。阶段1-3平均值之间的差异不显著。

**图2。蛋白质印迹法验证线粒体的富集**
A）用细胞器标记物特异性抗体（溶酶体、LAMP-1抗体、黑色素体、酪氨酸酶抗体、过氧化物酶体、过氧化氢酶抗体、细胞胞浆、Hsp70抗体、OM线粒体外膜、VDAC抗体）对RPE组分（匀浆、细胞溶质和线粒体）进行蛋白质印迹检测；IM——线粒体内膜，复合物I亚基6/ND6抗体；Mtx–线粒体基质，MnSOD抗体）。印迹表明，分馏过程导致细胞溶质组分中的线粒体选择性耗竭，线粒体组分中线粒体选择性富集。蛋白质负荷范围为5至35μg蛋白质，增量为5μg。HeLa细胞裂解物阳性对照用“+”表示。请注意，通过比较阳性对照反应强度，在明显过度暴露印迹后，仅在线粒体部分检测到微弱的Hsp70（细胞）反应。B）MGS阶段之间亚分馏功效的半定量比较。对每个阶段的多个样本进行细胞器标记的Western blot测量比较。每个胞浆免疫反应均归一化为相应的匀浆免疫反应，以解释样品之间的总含量差异。条形代表平均值±标准误差，每组n=6。通过单向方差分析，未检测到任何标记的显著差异，这表明细胞内容物分为胞质（即非线粒体）和线粒体部分不受MGS阶段的影响。

**图3。线粒体组分蛋白质的二维凝胶电泳分离**
展示100μg人类供体RPE线粒体部分蛋白分辨率的代表性凝胶。在第一维度中使用3-11的非线性pH梯度分离蛋白质，在第二维度中使用13%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后用银染色。通过单向方差分析或线性回归分析显著变化的点按照表2装箱并编号。

**图4。蛋白质斑点密度和相应的蛋白质特性**
将每个凝胶的单个斑点密度归一化为总斑点密度，并通过单向方差分析（A）和线性回归（L）进行比较。达到显著性的测试及其相关p值显示在归一化点密度之上，其报告为每个MGS阶段的平均±标准误差。每个阶段的测量次数显示在x轴下方。蛋白质鉴定（根据表2编号）通过MALDI-TOF质谱获得，并通过串联质谱肽测序进行验证。注意顶部和底部面板之间的y轴刻度差异。

**图5。线粒体ATP合成酶含量的二维凝胶分析**
A）质谱分析鉴定了多个ATP合酶α和β蛋白点，其等电聚焦点发生改变（等电变体，箭头）。根据初始2D凝胶分析，只有一部分等电变异体随着MGS阶段发生显著变化（根据表2编号）。当被鉴定为ATP合成酶α和β的斑点作为几个ATP合成素等电变体之一迁移时，ATP合成成酶δ似乎作为单个斑点迁移。B）总线粒体ATP合成酶α、β和δ的含量是通过将所有识别点的密度相加（用A中的箭头表示）来估算的。平均密度值和平均值的标准误差被归一化为最大密度值（每个亚基的MGS 2）。三个ATP合成酶亚基中每个亚基的单向方差分析均显著（均p<0.04）。

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1. Davis MD、Gangnon RE、Lee LY等。年龄相关性黄斑变性的年龄相关性眼病研究严重程度量表：AREDS第17号报告。Arch眼科。2005;123:1484–1498.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Coleman AL，Yu F.1995年至1999年年龄相关性黄斑变性患者的眼部相关医疗保险费用。眼科学。2007-公共医学
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