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.2008年4月9日；27(7):1110-21.
doi:10.1038/emboj.2008.31。 Epub 2008年3月13日。

Toll样受体控制自噬

莫尼卡·A·德尔加多 1, 拉沙·阿埃尔马乌德, 亚历山大·S·戴维斯, 乔治·凯伊, 德雷蒂奇
附属公司

Toll样受体控制自噬

莫尼卡·A·德尔加多等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

自噬是一种新发现的先天性防御机制，作为一种细胞自主系统清除细胞内病原体。目前尚不清楚在病原体入侵时诱导自噬的信号和信号途径。在这里，我们表明自噬是通过识别保守的病原体相关分子模式（PAMPs）来控制的。我们筛选了PAMP文库对RAW 264.7巨噬细胞自噬的影响，发现一些原型Toll样受体（TLR）配体诱导自噬。单牌RNA和TLR7产生了最有效的效果。通过TLR7诱导自噬依赖于MyD88的表达。即使目标病原体通常与TLR7信号传导无关，用TLR7配体刺激自噬也能清除细胞内微生物。这些发现将TLR信号和自噬这两个先天免疫防御系统联系在一起，为病原菌入侵诱导自噬提供了潜在的分子机制，并表明TLR配体刺激自噬的新认识能力可用于治疗细胞内病原体。

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数字

图1
图1
TLR7配体是LC3穿孔的强诱导剂。(A类)用GFP–LC3转染RAW 264.7巨噬细胞细胞，24小时后将细胞在饥饿培养基中培养2小时，或在完全培养基中单独培养4小时或在500 U/ml IFN-γ、1μg/ml Pam存在下培养4小时三CSK公司4，100 ng/ml帕姆2CSK公司4，25μg/ml聚（I:C），500 ng/ml LPS，1μg/ml鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白、10μg/ml咪喹莫德、10μg/ml ssRNA或3μM CpG寡核苷酸1826。棒材，5μm。(B类,C类)图A中RAW 264.7巨噬细胞中GFP–LC3斑点（⩾1μm）的定量。数据为平均值±s.e.m(n个⩾3);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05,†P（P）⩾0.05（方差分析（ANOVA））。(D类)用GFP–LC3ΔC22，G120A转染RAW 264.7巨噬细胞，24小时后，将细胞在饥饿培养基（Starv）中孵育2小时，或单独在完全培养基（C）中孵育4小时，或在10μg/ml咪喹莫特（Imiq）或10μg/ml ssRNA.Bar，5μm的存在下孵育。(E类)D组RAW 264.7巨噬细胞中GFP–LC3ΔC22，G120A puncta（⩾1μm）的定量。数据为平均值±标准偏差(n个=6);†P（P）⩾0.05（方差分析）。
图2
图2
TLR7配体诱导自噬。(A类)量化与GFP–LC3共转染的RAW 264.7巨噬细胞细胞中GFP–LC 3点（⩾1μm），并控制干扰siRNA（sc）或Beclin 1 siRNA。22 h后，将细胞与完全培养基单独培养4 h（C）或在10μg/ml咪喹莫特（Imiq）或10μg/ml ssRNA的存在下培养4 h，或在饥饿培养基（Starv）中培养2小时。数据为平均值±标准误差(n个=6);**P（P）<0.01（方差分析）。(B类)用对照干扰siRNA（sc）或Beclin 1 siRNA转染RAW 264.7巨噬细胞，24 h后用抗Beclin l或抗GAPDH抗体进行western印迹分析。(C类)将来源于GFP–LC3转基因小鼠的原代BMM在饥饿培养基中培养2小时，或在完全培养基中单独培养4小时（对照），或在10μg/ml咪喹莫特或10μg/ml ssRNA.Bar中培养4小时，5μm。(D类)在C组表达GFP-LC3的骨髓基质细胞中GFP-LC3-punta（⩾1μm）的定量。细胞仅用完全培养基（C）、咪喹莫特（Imiq）或ssRNA刺激。数据为平均值±s.e.m(n个=3). 完全正确P（P）-显示值（方差分析）。该图的全彩版本可在欧洲分子生物学杂志在线。
图3
图3
TLR配体刺激细胞中LC3-I到LC3-II转化的免疫印迹分析。(A类)在100 nM Bafilomycin A的存在下，在完全培养基（C）中或在1μg/ml Pam的存在下培养初级BMM 2小时三CSK公司4，25μg/ml聚（I:C），500 ng/ml LPS，1μg/ml鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白或10μg/ml ssRNA。使用抗LC3或抗肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞。显示了密度测定LC3-II/肌动蛋白比率（三个实验的平均值）。(B类)RAW 264.7巨噬细胞在100 nM Bafilomycin A存在下在完全培养基中培养30分钟、1小时或2小时(C类)或在10μg/ml ssRNA存在下。使用抗LC3或抗肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞。密度测定LC3-II/肌动蛋白比率显示为两个（30分钟和2小时）或三个独立实验（1小时）的平均值。（C） J774巨噬细胞在100 nM Bafilomycin A存在下单独在完全培养基（C）中培养1小时，或在10μg/ml ssRNA存在下培养1小时。使用抗LC3或抗肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞。印迹，1小时样品。印迹下方显示了1和4小时孵育时间点的LC3-II/肌动蛋白密度比值。
图4
图4
通过超微结构分析和监测长寿命蛋白质的降解来评估TLR7配体的自噬诱导。(A类,B类)RAW 264.7巨噬细胞在10μg/ml ssRNA存在下与（A）完全培养基单独培养4小时（对照）或（B）培养4小时后的电镜观察。箭头和放大区域显示自噬细胞器。(C类)器官表面在体积中的定量(S公司v（v）)（Weibel和Bolender，1973）针对自噬空泡（Eskalinen，2008）、线粒体和细胞核。**P（P）<0.05,†P（P）⩾0.05（方差分析）。(D类)在含有[三H] 亮氨酸。将细胞清洗，在完全培养基（含冷亮氨酸）中培养24小时，并在饥饿培养基（Starv）中培养4小时，或在完全培养液中单独培养4小时（C），或在补充10μg/ml咪喹莫特（Imiq）的完全培养基中培养24 h。亮氨酸释放是根据三羧酸可溶性形式的放射性相对于总细胞放射性计算的。数据为平均值±标准误差(n个=9);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05（方差分析）。(E类)在标记为面板D的RAW 264.7细胞中测量长寿命蛋白质的蛋白水解，刺激前用10μg/ml E-64d和10μg/ml胃蛋白酶抑制素A在完全培养基中预培养1h，并像面板D中一样刺激，但存在10μg/mlE-64d和和10μg/ml胃蛋白酶抑素A。数据为平均值±标准偏差(n个=3);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05,†P（P）⩾0.05（方差分析）相对于相应对照。线上的符号表示含有和不含E-64d+胃蛋白酶抑制素A的相同条件组样品之间的显著性；线下的符号表示相对于对照（C）的统计显著性。
图5
图5
TLR7负责ssRNA诱导的自噬。(A类)RAW 264.7巨噬细胞与GFP-LC3和对照扰民（sc）或TLR7 siRNA共同转染。46 h后，在10μg/ml ssRNA（ssRNA）存在下，仅用完整培养基（对照）培养细胞4 h，或在饥饿培养基中培养最后2 h（饥饿）。棒材，5μm。(B类)与A组一样转染并用10μg/ml ssRNA刺激的RAW 264.7巨噬细胞中GFP–LC3点（⩾1μm）的定量。插图，A组转染并在饥饿培养基中刺激2 h的RAW 2604.7巨噬细胞的GFP–LC点的定量。符号表示来自相同实验的成对数据：▴, 实验1；□ 实验2；♦ 实验3。P（P）-值，成对t吨-测试。(C类)用对照干扰siRNA（sc）或TLR7 siRNA转染RAW 264.7巨噬细胞，并在24、48或72小时后用抗TLR7或抗GAPDH抗体对细胞进行裂解和蛋白质印迹分析。该图的全彩版本可在欧洲分子生物学杂志在线。
图6
图6
TLR7配体诱导的自噬依赖于MyD88。(A类)用GFP-LC3和对照扰乱siRNA（扰乱）或MyD88 siRNA（MyD88）共转染的RAW 264.7巨噬细胞的共聚焦显微镜图像。22小时后，细胞在完全培养基中单独培养4小时（对照），或在补充有10μg/ml咪喹莫特或10μg/ml ssRNA的完全培养基上培养4小时，或在饥饿培养基中培养最后2小时。棒材，5μm。(B类)从面板A所示的实验中量化GFP–LC3 punta（⩾1μm）。数据为平均值±标准误差(n个=3）；*P（P）<0.05,†P（P）⩾0.05（方差分析）。(C类)用对照干扰siRNA（sc）或MyD88 siRNA（MyD）转染RAW 264.7巨噬细胞，并在24、48或72小时后用抗MyD88或抗GAPDH抗体对细胞进行裂解和免疫印迹分析。该图的全彩版本可在欧洲分子生物学杂志在线。
图7
图7
TLR诱导的自噬消除了细胞内卡介苗。(A类)RAW 264.7巨噬细胞被卡介苗感染1 h，清洗并在完全培养基中培养4 h（C），或在10μg/ml咪喹莫特（Imiq）或10μg/ml ssRNA存在下培养4 h，或在饥饿培养基（Starv）中培养。对细胞进行裂解，通过计数克隆形成单位来量化细菌存活率。数据为平均值±标准误差(n个=5);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05（方差分析）。(B类)RAW 264.7巨噬细胞转染对照干扰siRNA（sc）或TLR7 siRNA。46小时后，将细胞感染、清洗、孵育4小时，然后如面板A所示进行裂解。数据为平均值±s.e.m(n个=3);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05,†P（P）相对于对照组⩾0.05（方差分析）。括号中的符号表示与打乱siRNA组中同等处理的细胞相关的显著性。(C类)将RAW 264.7巨噬细胞转染对照干扰siRNA（sc）或MyD88 siRNA。24小时后，将细胞感染、清洗、孵育4小时并像面板A中那样进行裂解。数据为平均值±标准偏差(n个=6);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05,†P（P）相对于对照组⩾0.05（方差分析）。(D类)RAW 264.7巨噬细胞细胞转染对照干扰siRNA（sc）或Atg5 siRNA。24小时后，将细胞感染、清洗、孵育4小时，然后如图A所示进行裂解。数据为平均值±标准偏差(n个=6);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05,†P（P）相对于对照组⩾0.05（方差分析）。括号中的符号表示与来自干扰siRNA组的同等处理细胞相关的统计显著性。(E类)将RAW 264.7巨噬细胞转染为面板D中的巨噬细胞。24小时后，使用抗Atg5或抗肌动蛋白抗体对细胞进行裂解和免疫印迹分析。(F类)将RAW 264.7巨噬细胞转染对照干扰siRNA（sc）或Beclin 1 siRNA。24小时后，将细胞感染、清洗、孵育4小时并裂解，如面板A所示。数据为平均值±标准误差(n个=6);**P（P）<0.01,*P（P）<0.05,†P（P）相对于对照组⩾0.05（方差分析）。括号中的符号表示与打乱siRNA组中同等处理的细胞相关的显著性。(G公司)将RAW 264.7巨噬细胞转染为面板F中的巨噬细胞。24小时后，使用抗Beclin 1或抗肌动蛋白抗体对细胞进行裂解和免疫印迹分析。
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