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.2008年4月18日；283(16):10892-903.
doi:10.1074/jbc。M800102200。 Epub 2008年2月15日。

线粒体自噬是HIF-1依赖的缺氧适应性代谢反应

张华峰 1, Marta Bosch-Marce公司, 拉里萨·夏莫达, Yee Sun Tan先生, 金贤白（Jin Hyen Baek）, 雅各布·B·卫斯理, 弗兰克·冈萨雷斯, 格雷格·塞门扎
附属公司

线粒体自噬是HIF-1依赖的缺氧适应性代谢反应

张华峰等。 生物化学杂志. .

缩回

  • 撤药：线粒体自噬是HIF-1依赖的缺氧适应性代谢反应。
    Zhang H、Bosch-Marce M、Shimoda LA、Tan YS、Baek JH、Wesley JB、Gonzalez FJ、Semenza GL。 张华等。 生物化学杂志。2023年8月；299(8):105125. doi:10.1016/j.jbc.2023.105125。Epub 2023年8月7日。 生物化学杂志。2023 PMID：37556879 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

摘要

自噬是一种细胞质细胞器分解代谢的过程，可以去除有缺陷的结构，也可以作为在营养缺乏的情况下提供大分子以产生能量的手段。在本研究中，我们证明线粒体自噬是由缺氧诱导的，这一过程需要BNIP3的低氧依赖性因子1依赖性表达以及Beclin-1和Atg5的组成性表达，并且在长期缺氧的细胞中，线粒体自噬是一种适应性代谢反应，是防止活性氧水平升高和细胞死亡所必需的。

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数字

图1。
图1。
HIF-1对线粒体质量和呼吸的调节前任活泼地和体内.A类，比率线粒体：用实时定量PCR测定野生动物的核DNA类型(重量)和Hif1a型-/-(击倒对手)MEF公司暴露于20或1%O248小时，并根据结果进行归一化WT电池在20%O下获得2显示了平均值（±S.E.）。*,第页<0.05（学生）t吨在20%O下与WT MEF进行比较2;#,第页< 0.05与1%O时的WT MEF相比2.B类、WT和KO MEF为暴露于20或1%O248小时后，细胞数量相等壬基吖啶橙染色(NAO公司)并按流量进行分析细胞术测量线粒体质量。C类和D类,O（运行）2消费(C类)和ATP水平(D类)是以暴露于20或1%O的WT和KO MEF计量248小时和归一化为20%O下WT MEF的结果2.平均值显示值（±S.E.）。*,第页<0.05 by学生的t吨在20%O下与WT MEF进行比较2;#,第页与1%O下的WT MEF相比<0.052.E类，重量KO MEF暴露于20或1%的O248小时细胞用ER-Tracker染色并用流式细胞仪分析以测定内质网肿块。F类、WT和KO MEF用空逆转录病毒载体(电动汽车)或矢量编码构成活动HIF-1α(CA5公司). 3天后，线粒体与细胞核的比率DNA被测定。显示平均值（±S.E.）。*,第页<0.05用于指示比较。G公司和H（H），DNA从WT和Hif1a型+/-HIF-1α-HET窝鼠(G公司)或阿恩特flox/flox公司HIF-1β条件性敲除小鼠均为转基因小鼠(Cre公司+)或非转基因(Cre公司-)对于Tie2-Cre铁路(H（H）). 线粒体与核DNA的比值为通过实时PCR测定并归一化为WT的结果(G公司)或Cre-(H（H）)老鼠。*，平均值（±S.E。，n个＝3），其与WT显著不同，或者Cre公司-.
图2。
图2。
缺氧MEF中BNIP3表达的HIF-1依赖性诱导。 A类通过定量实时RT-PCR测定WT和暴露于20或1%O的KO MEF224小时平均值（±S.E.）如图所示。*,第页<0.05（学生）t吨测试与20%O时的WT MEF相比2;#,第页与之相比<0.05WT MEF为1%2.B类、BNIP3和β-肌动蛋白使用WT和KO MEF的裂解物通过免疫印迹法测定表达暴露于20或1%O248小时。C类和D类，BNIP3信使核糖核酸(C类)和蛋白质(D类)在WT和HET小鼠肺组织。*，平均值（±S.E。，n个=3）与WT显著不同执行以确认相等的蛋白质负荷。E类和F类，BNIP3信使核糖核酸(E类)和蛋白质(F类)水平分析Cre公司-和Cre+小鼠肺组织。*，平均值（±S.E。，n个=3）与Cre公司-.Tubulin用作加载控制。NS公司表示非特异性带。
图3。
图3。
BNIP3功能丧失对线粒体质量和呼吸的影响WT和KO MEF中。 A类和B类，定量实时逆转录聚合酶链反应(A类)和免疫印迹分析(B类)显示短发夹RNA分别下调BNIP3 mRNA和蛋白质在20或1%O温度下培养的细胞中的sh80和sh82224小时(A类)或48小时(B类). β-肌动蛋白印迹显示等蛋白加载。NS公司，非特异性带。C、 D、E、和F类,线粒体DNA含量(C类)，线粒体质量(D类),O（运行）2消费(E类)和ATP水平(F类)是用EV或载体稳定转染的MEF亚克隆测定编码sh80或sh82并在20或1%O培养248小时数据表示为平均值（±S.E.）。*,第页< 0.05由学生的t吨在20%O条件下与WT-EV MEF进行测试比较2;#,第页与1%O下的WT-EV MEF相比，<0.052.
图4。
图4。
BNIP3功能丧失对线粒体质量和呼吸的影响WT和KO MEF中。 A类，免疫印迹分析显示20或1%O培养的KO-BNIP3 MEF中的BNIP3蛋白248小时。β-肌动蛋白作为负荷控制。NS公司，非特异性带。线粒体DNA含量(B类)，线粒体质量(C类),O（运行）2消耗(D类)和ATP水平(E类)是在20或1%O培养的WT-EV、KO-EV和KO-BNIP3 MEF中测量248 h。数据表示为平均值（±S.E.）。*,第页<0.05（学生）t吨测试与WT-EV MEF的比较20%O2；#，第页<0.05，用于指示的比较(弯曲的管线).
图5。
图5。
Beclin-1是HIF-1依赖性线粒体调节所必需的MEF中的质量和呼吸。短表达WT和KO MEF的亚克隆针对Beclin-1的发夹状RNA(shBeclin公司)或是一份杂烩阴性对照(SNC公司)培养温度为20或1%2用于48h.线粒体DNA含量(A类)，线粒体质量(B类),O（运行）2消费(C类)和ATP水平(D类)是仔细斟酌的。显示平均值（±S.E.）。*,第页<0.05（学生）t吨在20%O条件下与WT-SNC进行对比试验2;#,第页与1%O下的WT-SNC相比，<0.052.
图6。
图6。
Atg5是HIF-1依赖性调节线粒体质量所必需的MEF中的呼吸。用siRNA转染WT和KO MEF针对Atg5(siAtg5)或对照siRNA(siCTR公司)并在20%O或1%O下培养248小时。线粒体DNA含量(A类)，线粒体质量(B类)，O型2消费(C类)和ATP水平(D类)进行了测量。显示平均值（±S.E.）。*,第页<0.05学生t吨在20%O条件下与WT-siCTR进行对比试验2;#,第页< 0.05与1%O时的WT-siCTR相比2.
图7。
图7。
HIF-1激活BNIP3-、Beclin-1-和Atg5-依赖的自噬低氧MEF。 A类WT和KO MEF的孵化率为20%或1%O（运行）248h，对全细胞裂解物进行免疫印迹使用抗LC3抗体进行检测。B类，WT和KO MEF是暂时的用编码GFP或GFP-LC3的载体转染，20%或1%孵育O（运行）2并用荧光显微镜进行分析。C类、KO-EV MEF以及稳定转染EV或载体的WT-MEF亚克隆表达针对BNIP3（sh82）的短发夹RNA转染载体GFP-LC3，在20或1%O培养基中培养2、和荧光显微镜分析。细胞显示的百分比计算相对于所有GFP阳性细胞的点状荧光。平均值显示数据（±S.E.）。*,第页与之相比<0.05在20%O条件下用GFP-LC3转染的WT-EV MEFs2;#,第页<与GFP-LC3转染的WT-EV MEF相比，在1%O时为0.052.D类，带有间断GFP-LC3荧光的细胞百分比为相对于WT-EV、KO-EV和KO-BNIP3 MEF中的所有荧光电池进行计算子克隆。*,第页与20%的WT-EV相比<0.05O（运行）2.E类，带有斑点GFP-LC3的细胞的百分比在表达短发夹RNA的WT-MEF亚克隆中计算荧光针对Beclin1(shBeclin公司)或SNC。平均数据（±S.E.）如图所示。*,第页与相比<0.0520%O时的WT-SNC2;#,第页与1%的WT-SNC相比，<0.05O（运行）2.F类，带有标点GFP-LC3的单元格百分比在表达小干扰的WT-MEF亚克隆中计算荧光抗Atg5的RNA(siAtg5)或阴性对照siRNA(siCTR公司). 显示平均数据（±S.E.）。*,第页与20%O下的WT-siCTR相比，<0.052;#,第页< 0.05与1%O时的WT-siCTR相比2.
图8。
图8。
BNIP3与Beclin-1竞争对Bcl2的约束。 A类，机械工程师暴露在20或1%的O中248小时，全细胞裂解(WCL公司)制备，并对等分样品进行直接免疫印迹化验(IB，左侧面板)或免疫沉淀后(IP（IP）)带有抗Bcl2抗体(右侧面板).B类和C类,稳定转染EV或编码Bcl2的载体的MEF暴露于20或1%O248小时，并分析线粒体与核DNA比率(B类)或GFP-LC3的点状荧光(C类). 平均数据（±S.E.）如图所示。*,第页与相比<0.0520%O时的WT-EV2;#,第页与1%的WT-EV相比<0.05O（运行）2.
图9。
图9。
HIF-1／BNIP3／Beclin／Atg6诱导的小鼠自噬的保护作用缺氧细胞。 A、 B、C、D、和E类，指示的MEF亚克隆培养温度为20或1%248小时用台盼蓝测定死亡细胞占总细胞数的百分比染色。显示平均数据（±S.E.）。*,第页<0.05（学生）t吨与中的控制WT MEF子克隆相比的测试每个条形图的第一列。#，第页<0.05表示比较(A类和B类)或与WT-SNC相比(C类),siCTR公司(D类)，或WT-EV(E类)1%O时2.F类,MEF培养温度为20或1%248小时，然后与流用7-AAD和磷脂酰乙醇胺标记的抗膜联蛋白V抗体细胞凋亡的细胞学分析。百分比（平均值±S.E.）膜联蛋白+/7-AAD公司-显示单元格。
图10。
图10。
ROS水平分析。相同数量的MEF子克隆培养温度为20或1%248小时，用1μ米二氯二氢荧光素二乙酸酯和氧化二氯荧光素的代谢(贴现现金流)由流量决定细胞术。
图11。
图11。
ROS清道夫拯救HIF-1α-MEF不足低氧诱导的细胞死亡。MEF暴露于20或1%的O2在25μ米超氧化物MnTMPyP歧化酶模拟物或载体控制(CTR公司).A类、ROS水平用二氯荧光素定量(贴现现金流)荧光。B类，细胞死亡百分比（平均值±S.E.）由台盼蓝定量蓝色染色。*,第页<0.05（学生）t吨测试与20%O时的WT-CTR相比2;#,第页与之相比<0.05WT-CTR为1%O2；**,第页<0.05表示比较。C类，调节线粒体的分子途径MEF患者的自噬、细胞呼吸、ROS水平和细胞存活延长缺氧时间。
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