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.2008年4月；19(4):1772-82.
doi:10.1091/mbc.e07-07-0652。 Epub 2008年2月13日。

RASSF7是RAS关联域蛋白新家族的成员，是完成有丝分裂所必需的

维多利亚·舍伍德 1, 里亚·曼博德, 卡罗尔·谢泼德, 安德鲁·查尔默斯
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RASSF7是RAS关联域蛋白新家族的成员，是完成有丝分裂所必需的

维多利亚·舍伍德等。 分子生物学细胞. 2008年4月.

摘要

有丝分裂是所有细胞生物的基本特征。它必须严格控制，以允许正常组织生长并防止癌症形成。在这里，我们确定了一种有丝分裂所需的新蛋白质。我们表明，Ras结合（RA）域包含蛋白RASSF7是四种蛋白质进化保守组的一部分。这些是RASSF7、RASSF8和两个新的RASSF蛋白P-CIP1/RASSF9和RASSF10。我们称这个组为N末端RASSF家族。我们分析了Xenopus RASSF7的功能。RASSF7被发现在包括皮肤、眼睛和神经管在内的几种胚胎组织中表达。破坏其功能导致细胞不能形成有丝分裂纺锤体并阻止有丝分裂。这导致了细胞核破裂、细胞凋亡和神经管组织结构的显著丧失。RASSF7蛋白定位于中心体，这与纺锤形成的作用一致。这种定位以微管依赖的方式发生，表明RASSF7定位和纺锤体形成之间存在相互依赖的关系。因此，RASSF7是N末端RASSF家族的第一个要进行功能分析的成员，是一种中心体相关蛋白，需要在神经管中形成纺锤体和完成有丝分裂。

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图1。
图1。
RASSF7属于一个新的蛋白质家族，与人类基因组中的Ras基因共定位。（A） 经典和N末端（NT）RASSF家族的示意图：经典人类家族RASSF1-6和经典果蝇属RASSF（dmRASSF）、NT系列RASSF7–10和果蝇属类似RASSF7/8（dmRASSF8/8）。请参见材料和方法登录号。C1，蛋白激酶C保守区1（灰色）；萨拉、萨夫/RASSF/河马（斑点）；锌指（已检查）；线圈（黑色）；和RA、Ras-关联域（条带化）。NT-RASSF代表了与经典RASSF不同的蛋白质家族。（B） 人类11号和12号染色体的图形表示（从Ensembl修改而来），显示NT-RASSF基因在各种Ras亚型附近映射。例外是P-CIP1/RASSF9，我们在附近找不到Ras基因。
图2。
图2。
RASSF7在发育中的表达爪蟾胚胎。（A） 早期的RT-PCR分析爪蟾开发RASSF7系统作为控制鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因。PCR中使用了30个周期。RASSF7系统显示母体和合子表达。（B） 组织特异性表达模式RASSF7系统在第16、20和30阶段进行原位杂交分析。显示了每个阶段的整体安装和横截面。表皮；np，神经板；嘿，眼睛；br、脑；nt，神经管；pn，原麻黄碱；lm，侧板中胚层；ba，鳃弓；ov，耳囊；三叉神经节tg。以下是RASSF7公司在许多胚胎组织中。
图3。
图3。
敲除RASSF7表达会导致发育缺陷。（A） 16期未注射和MO注射胚胎的HA标记RASSF7（56 kDa）免疫印迹。注射的胚胎注射20 ng MO和2 ng HA-RASSF7系统RNA在双细胞期进入两个细胞。α-微管蛋白显示为负荷控制（50 kDa）。MO1能够消除胚胎中标记的RASSF7。（B） 侧视图和背视图爪蟾胚胎注射吗啉（MO）、两个RASSF7-MO（MO1和MO2）和一个对照MO（Con-MO）。RASSF7敲除胚胎显示出短而弯曲的身体轴，眼睛色素沉着减少，发育延迟。（C） 根据四个独立实验（Con-MO，n=375；MO1，n=359；MO2，n=345）计算出每个MO在第39阶段受影响胚胎的百分比。（D） 通过注射RASSF7系统RNA。（E） 救援实验的量化（根据三个独立实验计算的百分比；RNA，n=157；MO2，n=171；RNA+MO2，n=166）。
图4。
图4。
RASSF7基因敲除导致明显的神经管缺陷。（A） 舞台示意图39爪蟾蝌蚪表示切片的前/后水平。根据之前的工作改编自Xenbase图像的图表（Nieuwkoop和Faber，1967）。切片穿过耳囊泡（OV）。（B） 对注射Con-MO或MO1的39期胚胎进行切片，并用苏木精和伊红染色。心室(▴) 与对照组相比，MO1注射胚胎中的细胞数量减少，称为“中度受累”或完全丧失，因此称为“严重受累”。在MO1注射的胚胎中，细胞从大脑软脑膜区扩散到通常由结缔组织占据的区域（箭头所示）。（C） 发育中的脑组织用极性标记物染色：抗层粘连蛋白（绿色）、阴茎倍体蛋白（红色），并用DAPI（蓝色）进行复染。图像来自与A类似的AP位置，聚焦于脊索（NC）上方的神经管。中度和重度受累组织的组织极性均被破坏。所有钢筋，10μm。
图5。
图5。
RASSF7基因敲除导致发育中神经管的核分裂和细胞死亡。（A） MO注射胚胎中神经细胞的Sytox-Green染色。在RASSF7击倒组织中观察到不同大小的核碎片（箭头），而对照组织中不存在这些核碎片。（B） sytox绿色染色显示，RASSF7敲除胚胎的脊索、体节和发育中的肠道（内胚层）中未观察到核碎片。这些组织中未观察到RASSF7的表达。MO1脊索图像中的箭头突出显示了向脊索扩散的受影响神经组织。（C） 神经组织切片TUNEL染色（红色）或抗活性caspase 3（绿色），DAPI复染（蓝色）。箭头表示非凋亡阳性的碎片细胞核。（D） 图表显示细胞死亡的百分比。***p<0.001，两个MO的三个实验中n=9（TUNEL）；两个MO（活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3）的三个独立实验得出n=3。每个样本中都有7000多个细胞。误差条，SD。所有条，10μm。
图6。
图6。
RASSF7是神经管纺锤体形成和有丝分裂完成所必需的。（A） 中心体数量不受RASSF7基因敲除的影响。γ-微管蛋白染色（红色）用于检查Con-MO-和MO1-注射胚胎神经管的中心体（箭头突出显示），并用DAPI（蓝色）进行复染。VC，心室腔。（B） 神经管中的中心体数量不受RASSF7基因敲除的影响。Con-MO和MO1之间无显著差异；n=来自三个独立实验的每个MO的6个试样。（C） 用抗磷酸S10组蛋白H3（绿色）和DAPI（蓝色）染色检测MO注射胚胎神经管中的细胞增殖。（D） 磷脂酶H3增殖细胞的数量占计数细胞总数的百分比（DAPI染色）。两种MO组织的增殖相似，无显著差异。在两个MO的三次注射实验中，n=9，每个单独的样本中，计数>7000个细胞。（E） 以下阶段的分裂细胞计数：前期（也包括前中期），*p<0.05；中期，无显著差异；后期（也包括末期），**p<0.01。DAPI染色根据以下标准区分有丝分裂期：前期/中期，浓缩DNA；中期，遗传物质排列在中期板上；后期/末期，染色体分离。计数来自三个实验（Con-MO，n=90；MO1，n=90.）。所有误差条，SD。敲除细胞在早期有丝分裂中停止。（F） 心轴总数占分裂细胞总数的百分比。*p<0.05，每个MO有6个样本，来自三个实验。分裂的RASSF7敲除细胞中有丝分裂纺锤体的数量大大减少。（G） α-微管蛋白染色（绿色）用于显示神经管有丝分裂细胞中的纺锤体，而γ-微管素染色用于标记中心体（红色）。切片用DAPI（蓝色）复染。分裂的RASSF7敲除细胞中有丝分裂纺锤体缺失，或偶尔出现异常。所有钢筋，10μm。RASSF7敲除细胞由于纺锤体形成不足而无法通过有丝分裂进行。
图7。
图7。
RASSF7定位于中心体。（A） 在双细胞阶段将胚胎注射GFP-RASSF7，培养至第10阶段，按照材料和方法。GFP-RASSF7（绿色）在间期和前期（分别为箭头和箭头）以及中期和后期（箭头）与γ-微管蛋白（红色）共定位。切片用DAPI（蓝色）复染。该定位已在三个以上的独立实验中重复进行。（B） RASSF7-HA（红色）和GFP-RASSF7（绿色）在10期胚胎中的定位相同。显示相间细胞。（C） 晚期胚胎（20期）也有中心体定位的GFP-RASSF7（绿色），如γ-微管蛋白（红色）所示。图片显示了一个20级胚胎的神经管。VC，心室腔。所有钢筋，10μm。RASSF7在整个细胞周期中与γ-微管蛋白共定位。
图8。
图8。
RASSF7的中心体定位需要微管。（A） 用20μg/ml诺卡唑处理2小时后，细胞中的微管消失。用α-微管蛋白（红色）染色10期胚胎动物帽的微管，用DAPI（蓝色）观察细胞核。（B） 诺卡唑治疗导致中心体GFP-RASSF7（绿色）定位丢失。γ-微管蛋白染色中心体（红色），细胞核DAPI（蓝色）复染。所有钢筋，10μm。
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