Mitochondrial lactate dehydrogenase is involved in oxidative-energy metabolism in human astrocytoma cells (CCF-STTG1)

doi:10.1371/journal.pone.0001550

.2008年2月6日；3（2）：e1550。

doi:10.1371/journal.pone.0001550。

线粒体乳酸脱氢酶参与人星形细胞瘤细胞（CCF-STTG1）的氧化能代谢

约瑟夫·莱米尔¹, Ryan J Mailloux先生, 瓦苏D阿帕那

附属公司

PMID： 18253497
预防性维修识别码： PMC2212712型
内政部： 10.1371/日志.pone.0001550

线粒体乳酸脱氢酶参与人星形细胞瘤细胞（CCF-STTG1）的氧化能代谢

约瑟夫·莱米尔等。公共科学图书馆一号. 2008.

.2008年2月6日；3（2）：e1550。

doi:10.1371/journal.pone.0001550。

作者

约瑟夫·莱米尔¹, Ryan J Mailloux先生, 瓦苏D阿帕那

附属

¹加拿大安大略省萨德伯里市劳伦斯大学化学与生物化学系。

PMID： 18253497
预防性维修识别码： PMC2212712型
内政部： 10.1371/journal.pone.0001550

摘要

长期以来，乳酸被视为无氧能量生产的最终产物，其在大脑代谢中的命运尚未被准确描述。在本报告中，我们首次证明了人类星形细胞细胞系（CCF-STTG1）通过氧化磷酸化消耗乳酸和生成ATP的能力。（13） C-NMR和HPLC分析有助于鉴定与乳酸孵育的星形细胞线粒体中的三羧酸（TCA）cyle代谢物和ATP。草酸盐是乳酸脱氢酶（LDH）的抑制剂，可消除线粒体乳酸的消耗。电泳和荧光显微镜分析有助于定位线粒体中的LDH。总之，这项研究表明乳酸是大脑中ATP代谢的重要贡献者，这一发现可能会显著改变我们对这个重要器官如何控制其能量收支的概念。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。星形细胞系对乳酸的利用。**
CCF-STTG1培养物在无血清培养基中补充2.5 mM乳酸。在不同的时间间隔使用HPLC（Reezex有机酸柱）进行乳酸测定。使用台盼蓝排除试验进行活细胞计数对应于在无血清α-MEM+2.5 mM乳酸中生长的星形细胞的活细胞数。○ 对应于在无血清α-MEM中生长的星形细胞的活细胞数。▪ 对应于废液（乳酸培养物）中乳酸的相对含量。n个 = 3，平均值±SD

**图2。线粒体消耗的乳酸来自这个星形细胞系。**
一）线粒体与5mM乳酸和0.1mM NAD孵育⁺用HPLC测定线粒体乳酸的时间依赖性消耗。二）线粒体和细胞质组分的纯度分别用VDAC和F-actin确认。三）使用核磁共振波谱确认线粒体乳酸消耗。分别在15min和60min后采集数据。n个 = 3，平均值±SD

**图3。乳酸是星形细胞系线粒体能量的来源。**
线粒体与5 mM乳酸或5 mM柠檬酸盐、0.1 mM NAD孵育⁺和0.1 mM ADP用于不同的时间间隔。核苷酸水平使用C₁₈反相柱。一）线粒体中的ATP/ADP比率。开杆□ = ADP和闭合条▪ = ATP II）NAD⁺/与乳酸孵育的线粒体中的NADH比率。开放式酒吧□ = NADH和闭合棒▪ = 北美⁺.通过使用已知标准和添加样品来确定峰值。n个 = 3，平均值±SD

**图4。星形细胞线粒体中乳酸的氧化代谢。**
从CCF-STTG1细胞分离的线粒体在10 mM培养¹³C类_三–乳酸，0.1 mM NAD⁺和1µM NaN_三用于不同的时间间隔。通过I）HPLC和II）NMR光谱测量TCA循环中间体的积累。HPLC组分也通过酶分析（柠檬酸盐、琥珀酸盐和富马酸盐）进行了确认。

**图5。乳酸促进星形细胞线粒体的有氧呼吸。**
一）分离星形细胞系的线粒体，利用氧电极（Orion®）测量5分钟内的耗氧量。线粒体与5 mM底物、0.5 mM NAD孵育⁺和0.5 mM ADP。还分析了反应缓冲液空白，以确保正确的仪器校准。二）细胞色素C氧化酶的凝胶活性。A） CCF-STTG1细胞与2.5 mM乳酸盐一起孵育。B） CCF-STTG1细胞与2.5mM葡萄糖孵育。C） CCF-STTG1细胞；用2.5 mM柠檬酸盐培养。

**图6。线粒体乳酸代谢。**
分离CCF-STTG1细胞的线粒体，并与5 mM乳酸和0.1 mM NAD孵育⁺在存在或不存在10 mM草酸盐的情况下，适用于不同的时间间隔。通过高效液相色谱法测量相对乳酸水平。• = 线粒体缺乏10mM草酸盐。▴ = 存在10mM草酸盐的线粒体。n个 = 三；标准偏差

**图7。星形细胞系LDH的BN-PAGE分析。**
一）线粒体部分。二）可溶部分。A）考马斯染色法检测猪心乳酸脱氢酶（Sigma）。B）猪肌肉LDH考马斯染色（Sigma）。C）用0 mM NAD凝胶内检测LDH活性⁺D）用0.1 mM NAD凝胶内检测LDH活性⁺E）用0.5 mM NAD凝胶内检测LDH活性⁺.F）用0.5 mM NAD凝胶内检测LDH活性⁺和2mM AgNO_三.

**图8。LDH的2D免疫印迹分析。**
从BN-PAGE实验中分离出活性条带，并在10%SDS-PAGE上运行。A）上层带（线粒体部分）。B）下带（线粒体部分）。C）可溶部分带

**图9。乳酸脱氢酶在线粒体中的定位。**
分离线粒体并将其分离为A）线粒体和B）外膜和内膜空间部分。一）线粒体部分LDH1的免疫印迹。二）对Cyt C和SDH进行免疫印迹以确定线粒体部分的纯度。Std对应于来自猪心的LDH（Sigma）。

**图10。星形细胞系中的乳酸脱氢酶定位。**
A）核的Hoechst染色。B）罗丹明B染色用于线粒体定位。C） FITC标记为二级抗乳酸脱氢酶。D）合并了赫斯特、罗丹明B和FITC的图像。注：黄色斑点表示与线粒体相关的LDH。

**图11。线粒体LDH在星形细胞系中的多功能作用。**
乳酸可以通过直接摄取或通过糖酵解途径转化葡萄糖获得。

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