A role for lengsin, a recruited enzyme, in terminal differentiation in the vertebrate lens

doi:10.1074/jbc.M709144200

.2008年3月7日；283(10):6607-15.

doi:10.1074/jbc。m709114200。 Epub 2008年1月3日。

lengsin，一种被募集的酶，在脊椎动物晶状体的终末分化中的作用

基思·怀亚特¹, 春高, 蔡仁岳, 罗伯特·法利斯, 苏加塔·雷, 格雷姆·维斯托

附属公司

PMID： 18178558
预防性维修识别码： PMC2911820型
内政部： 10.1074/jbc。M709144200型

精氨酸（一种补充酶）在脊椎动物晶状体末端分化中的作用

基思·怀亚特等。生物化学杂志. 2008.

.2008年3月7日；283(10):6607-15.

doi:10.1074/jbc。M709144200。 Epub 2008年1月3日。

作者

基思·怀亚特¹, 春高, 蔡仁岳, 罗伯特·法利斯, 苏加塔·雷, 格雷姆·维斯托

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家眼科研究所，邮编：20892。

PMID： 18178558
预防性维修识别码： PMC2911820型
内政部： 10.1074/jbc。M709144200型

摘要

冷蛋白是谷氨酰胺合成酶（GS）超家族中的一个眼睛晶状体特异性成员。冷蛋白没有GS活性，这表明它在晶状体中具有结构作用，而不是催化作用。原位杂交和免疫荧光显示，在终末分化的二级晶状体纤维细胞中表达了lengsin。酵母双杂交（Y2H）和重组蛋白实验表明，全长长链蛋白能够结合波形蛋白的2B丝状区。在亲和层析中，冷菌素还结合CP49（BFSP2；phakinin）的等效区域，CP49是一种与晶状体特异性相关的中间丝蛋白。波形蛋白和CP49 2B片段在表面等离子体共振光谱中结合长度蛋白，具有快速结合和缓慢解离动力学。晶状体蛋白的表达与成熟晶状体纤维细胞中的过渡区有关，其中细胞骨架被重组。Lengsin和晶状体中间丝蛋白共同定位于成熟纤维细胞的质膜上。这表明，在晶状体的末端分化过程中，lengsin可能作为细胞骨架本身的一种成分，或作为中间丝蛋白重组的伴侣。

PubMed免责声明

数字

**图1。Lengsin是特定于透镜的**
A类用生物素化小鼠长度蛋白cDNA探测小鼠组织的多期Northern印迹，并用ECL观察。强信号仅在眼睛中可见，略高于18S rRNA的大小（超过2kb）。B类用小鼠lengsin cDNA对大鼠晶状体和视网膜组织进行Northern杂交。Lengsin信号见于成人晶状体，但不见于视网膜或新生儿晶状体上皮(勒)或透镜光纤(*Lf（磅）*).C类Western blot检测到成年小鼠晶状体中纤维细胞而非上皮细胞中的凝集素。

**图2。晶状体蛋白mRNA对成熟的晶状体纤维细胞具有特异性**
成年小鼠眼ISH，用放射性标记的反义和感观探针检测小鼠眼长。*面板a*，整个眼睛。一圈银色颗粒标志着透镜中的透镜(箭头).面板b详细视图显示，ISH信号仅限于细胞核丢失前的细胞层。*面板c*，检测探针版本*面板a.面板d*，检测探针版本*面板b*.

**图3。免疫荧光法在成年小鼠晶状体中的定位**
抗鼠长度信号为绿色; 细胞核用DAPI染色(蓝色). 晶状体上皮(勒)以及弓形区域（纤维细胞伸长的区域）。在成熟和成熟的二级纤维细胞中可见强烈的纵长素免疫反应。箭头表示细胞核染色严重。上皮区可见一些信号，但这可能是切片伪影。晶状体中心的未染色区域对应于晶状体核，主要由初级晶状体纤维细胞组成，在这一节中完整无缺。

**图4。Y2H筛选lengsin结合伙伴**
A类4DO（-Ade，-His，-Leu，-Trp）和1DO（-Trp。酵母在4DO培养基上的生长和活化β-半乳糖苷酶表明酵母中诱饵和猎物的相互作用。B类，来自Y2H的小鼠波形蛋白猎物结构域序列，与小鼠CP49和菲林菌素的等效区域对齐。对于重组蛋白的生产，Y2H衍生的序列在两端略微延长(*斜体字*)在丝蛋白中完成七肽重复。显示了小鼠蛋白质的序列号。相同的残留物是*装箱的*.C类，Vim2B结构域在波形蛋白卷曲二聚体全长模型中的位置示意图（改编自Strelkov等。, 20).

**图5。重组凝集素与波形蛋白的结合**
A类，通过尺寸排除色谱法对共表达的lengsin和Vim2B结构域进行共纯化。图中显示了凝胶过滤柱中蛋白质组分的考马斯蓝染色SDS-PAGE。这个*下部面板*显示了重组Vim2B单独的洗脱曲线，在相同条件下以较小的表观尺寸洗脱。B类通过阳离子交换对共表达的lengsin和Vim2B结构域进行共纯化。显示在左边是共表达的lengsin和Vim2B的全细胞提取物的SDS-PAGE大肠杆菌. The主面板显示了阳离子交换柱中选定部分的SDS-PAGE。这个*图形线*表示各部分的盐浓度。

**图6。分离的纵梁蛋白和波形蛋白的共免疫沉淀**
如图所示，用抗波形蛋白的V9或7752抗体处理棱蛋白和波形蛋白溶液。免疫沉淀(*IP（IP）*)然后用蛋白质印迹法检测蛋白质的长度(左边)和波形蛋白(*正确的*). 两种波形蛋白抗体都能免疫沉淀波形蛋白(*正确的*). 此外，V9共沉淀长度(左边).

**图7。冷蛋白在亲和色谱中与HA-CP492B相互作用**
HA-CP492B预先绑定到HA列以创建CP492B亲和列(左边). 空白HA柱用作阴性对照(*正确的*). 在两个色谱柱上都应用了重组长度。图中显示了未结合的lengsin的Western印迹(*联合国*)，清洗1(*第1周*)，清洗2(*第2周*)，然后洗脱(*El公司*)分数。只有在CP492B配体存在的情况下，才能保留在色谱柱上，并通过HA肽洗脱释放。

**图8。波形蛋白和CP49的2B丝状区与SPR中的棱蛋白相互作用**
冷新绑定到CM5传感器芯片（Biacore）。Vim2B型(*上部面板*)和HA-CP492B(*下部面板*)溶液被用作分析物来测量结合活性。面板显示共振装置(*俄罗斯*)多种浓度或任一分析物的痕量(*V（V）*或C类)如所示μ克/毫升。B类表示空白。A类和天指示关联（分析物注射开始到结束）和分离阶段。

**图9。成年小鼠晶状体中透镜蛋白和主要晶状体中间丝蛋白的定位**
*面板a*成年小鼠晶状体中波形蛋白和纵梁蛋白的免疫荧光。红色显示vimentin，绿色显示lengsin，以及蓝色是细胞核的DAPI染色。*面板b*珠丝蛋白和长链蛋白的免疫荧光。红色显示珠状细丝（菲林菌素和Cp49），绿色显示lengsin，以及蓝色是细胞核的DAPI染色。*面板c*，高分辨率图像对应于*面板a*显示波形蛋白和纵梁蛋白在晶状体纤维细胞边缘的定位。*面板d*，高分辨率图像对应于*面板a*，显示珠状丝蛋白和lengsin在晶状体纤维细胞边缘的定位。

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1. Harding JJ、Crabbe MJC。在：眼睛。Davson H，编辑。1B、。学术出版社；纽约：1984年。第207–492页。
1. Zelenka PS.国际开发生物学杂志。2004;48:857–865.-公共医学
1. Kuszak JR、Zoltoski RK、Sivertson C.Exp Eye Res.2004；78:673–687.-公共医学
1. Maisel H、Harding CV、Alcala JR、Kuszak J、Bradley R、Bloemendal H。眼睛晶状体的分子和细胞生物学。威利跨科学；纽约：1981年。第49-84页。

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