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.2007年12月26日;104(52):20826-31.
doi:10.1073/pnas.0710017104。 Epub 2007年12月17日。

ARC对p53四聚体和核输出的调控

附属公司

ARC对p53四聚体和核输出的调控

罗杰·S-Y·福等。 美国国家科学院程序. .

摘要

转录因子p53的失活是致癌的关键。然而,只有大约一半的癌症有p53功能丧失突变。在这里,我们证明了凋亡抑制因子通过caspase募集域(ARC)(一种在多个癌细胞中诱导的蛋白)使p53失活的机制。ARC核与p53四聚体结构域的直接结合抑制了p53的四聚体。这暴露了p53的核输出信号,触发了p53向细胞质的Crm1依赖性重定位。乳腺癌细胞内源性ARC的敲除导致内源性p53的自发四聚体化,p53在细胞核中的积聚,以及内源性p53-靶基因的激活。在具有核ARC的原发性人类乳腺癌中,p53几乎总是WT。相反,几乎所有具有突变p53的乳腺癌都缺乏核ARC。我们得出结论,核ARC是在癌细胞中诱导的,对p53起负调控作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
内源性ARC与内源性p53相互作用,调节p53依赖的细胞死亡和转录。(A类)MCF7细胞中内源性ARC与内源性p53相互作用。进行免疫沉淀(IP),通过SDS/PAGE进行解析,并通过Western blotting(WB)进行分析。输入通道中含有3%用于免疫沉淀的裂解物。(B类)ARC抑制p53诱导的细胞凋亡。用所示质粒转染ARC水平低的HEK293细胞,并通过核浓缩细胞百分比(平均值±SEM)评估细胞死亡。*,P(P)<0.01,泳道4与泳道2。**,P(P)<0.01,车道5与车道4(学生t吨测试)。WB证实了ARC和p53的表达。(C类)ARC抑制p53依赖性报告基因的转录。ARC缺陷的U2OS细胞被转染了指定的质粒。PG13-Luc是一个p53依赖性萤火虫荧光素酶报告基因,包含13个p53响应元件,而MG15-Luc是一个包含15个突变p53响应元素的对照。此外,组成驱动雷尼利亚纳入荧光素酶报告基因进行归一化。p53依赖性转录由萤火虫的比率表示/雷尼利亚荧光素酶活性。*,P(P)<0.01,第5车道与第4车道。**,P(P)<0.01,8–10车道与6车道(学生车道t吨测试)。WB证实p53和ARC的表达。(D类)ARC抑制内源性p53依赖基因的激活。用所示质粒转染U2OS细胞。36小时后,用1μM阿霉素(dox)处理细胞4小时,然后进行WB。
图2。
图2。
p53的四聚体结构域直接与ARC结合。如图所示,将纯化的重组GST-p53肽与纯化的重组His全长ARC混合,并通过免疫沉淀(IP)-蛋白质印迹(WB)进行分析。
图3。
图3。
ARC干扰p53四聚体,刺激p53核超输出,并独立抑制p53依赖性转录。(A类)ARC抑制p53四聚体。如图所示转染Saos2细胞,并用增加浓度的戊二醛处理裂解产物(参见材料和方法)用SDS/PAGE分离,Western blotting(WB)分析。(B类)WT和核定位ARC以Crm1依赖的方式刺激p53 C末端片段(GFP-p53CT)的核输出。用GFP-p53CT(包含四聚体结构域)和载体(第1行)、WT-ARC(第2行)或核定位ARC(第3行和第4行)转染Saos2细胞。转染后36 h,用LMB(10 ng/ml)处理或不处理细胞6 h,并用GFP荧光、ARC免疫荧光和Hoechst 33258复染进行分析。(比例尺,20μm)(C类)WT和核定位ARC以Crm1依赖的方式刺激全长p53的核输出。如前所述,转染Saos2细胞。转染后36小时,细胞接受或不接受LMB处理6小时并进行分馏。核能(上部)和细胞质(下部)馏分用WB分析。(D类)核型ARC独立于其对p53核输出的刺激而抑制p53依赖性转录。如图所示转染U2OS细胞。然后用LMB(转染后36小时开始,直到46小时收获)和/或dox(转染后42小时开始,直到收获)处理或不处理细胞。用WB分析裂解产物。
图4。
图4。
内源性ARC抑制内源性p53四聚体、核定位和p53依赖性基因表达。(A类)MCF7细胞内源性ARC的敲除刺激内源性p53的自发二聚化和四聚化。用对照或ARC siRNA转染MCF7细胞,并按所述评估p53四聚体。(B类C类)内源性ARC的敲除将内源性p53重新定位到MCF7细胞的细胞核。用对照或ARC siRNA转染MCF7细胞。转染后48小时用ARC和p53免疫荧光分析,并用Hoechst 33258进行复染。(比例尺,20μm)(B类)图表显示平均值±SEM。结果是三个独立实验的平均值,得分为300-400个细胞。*,P(P)ARC siRNA与对照siRNA(学生的t吨测试)。(C类)细胞核和细胞质组分的蛋白质印迹(WB)分析。(D类)敲除MCF7细胞内源性ARC激活内源性p53依赖性基因表达。用对照或ARC siRNA转染MCF7细胞,转染48 h后获得的裂解产物用WB分析。

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引用人

工具书类

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