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.2008年2月1日;283(5):2973-85.
doi:10.1074/jbc。M705795200。 Epub 2007年11月29日。

α1a肾上腺素能受体与其G蛋白效应器一起占据膜筏,但通过网格蛋白包被的小孔内化

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α1a肾上腺素能受体与其G蛋白效应器一起占据膜筏,但通过网格蛋白包被的小孔内化

丹尼尔·莫里斯等。 生物化学杂志. .

摘要

α(1a)-肾上腺素能受体(α(1a-AR)在天然和异源表达系统中占据细胞内和质膜。基于多条独立的证据,我们证明细胞表面的α(1a)AR占据膜筏,但在刺激后从筏中退出。在非洗涤剂筏制剂中,基底α(1a)AR存在于低密度膜筏中,并在密度梯度上与其G蛋白效应器共定位。用甲基-β-环糊精消耗胆固醇破坏筏,消除这些轻筏。为了证实α(1a)AR在质膜筏中的存在,使用荧光共振能量转移测量来证明表面受体和筏标记霍乱毒素B的共定位。用苯肾上腺素刺激α(1aAR后,共定位大部分丢失。类似地,受体刺激导致α(1a)AR在3-10分钟内从光筏中退出,而G蛋白主要留在光筏中。重要的是,α(1a)AR的延迟退出提示急性受体信号和脱敏完全发生在筏内。有趣的是,共聚焦分析和表面α(1a)AR水平的测量均表明,在刺激后10分钟内,受体内部化适度,表明大多数受体已进入非筏血浆。然而,激活确实会增加受体内化的速率,甲基-β-环糊精对筏的破坏也会增加受体的内化速率,这表明筏的退出能够实现内化。表面标记的血凝素-α(1a)AR的共聚焦分析表明,与先前的间接证据一致,在固定细胞中,基底受体和受刺激受体占据了网格蛋白凹坑。这里提出的证据强烈表明,α(1a)AR是基础条件下的脂筏蛋白,并暗示激动剂介导的信号转导发生于脂筏。

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数字

图1
图1。膜筏程序和α1a个筏内AR定位
A类在将细胞从平板上刮下并造粒后,含有大多数细胞溶质蛋白和一些细胞碎片的CS被移除。在再悬浮之后,使用多次注射器冲程对细胞进行剪切。较重且未拉伸的膜结构被制成颗粒(佩尔),将上清液回收为粗脂筏提取物(提取),通常冷冻后使用。这种提取物是用Optiprep制成的,并在五步Optiprep密度梯度下放置。然后,超速离心使较轻的脂筏在梯度上向上漂浮,然后从上到下收集部分。B类C类,非洗涤剂膜筏的Western blot分析显示α1a个AR存在于轻密度和假定的中等密度筏中。细胞受到剪切使用慢(B类)而且速度很快(C类)注射器抽吸(见“实验程序”)。细胞上清液(反恐精英),未抽出的颗粒(佩尔)和粗筏提取物(提取)与密度梯度分数一起显示。标志车道由负载允许直接比较分数(参见“实验程序”)。透明质酸-α1a个使用3F10-HRP检测到的AR显示了代表单体和二聚体受体的条带,其中一些是糖基化的(表示为u个). 结果代表了缓慢的抽签(n个=11)和快速抽签(n个=7)程序。
图2
图2。胆固醇缺乏会导致轻密度和假定的中等密度的木筏丢失,木筏中含有α1a个AR公司
A类,细胞生长在37°C的培养基中,在收获用于制备粗筏提取物之前,用不同浓度的MCD处理指定的时间。西方对梯度组分的分析表明HA的损失在增加-α1a个增加胆固醇提取的AR。B类,HA的相对定量-α1a个粗筏提取物中的AR(提取)与颗粒中未抽出的受体相比(佩尔). 最高颗粒浓度和重复提取通道包含每个样品的0.56%。HA的相对定量-α1a个摘录中的AR显示在正确的并通过在适当的较高和较低颗粒值之间进行插值得到。
图3
图3。受体光漂白FRET显示α1a个细胞表面的AR和筏标记CT-B
HA转染COS-7细胞α1a个-使用CT-B Alexa Fluor 555在冰上预先标记ARs-ECFP或ECFP 24小时,然后立即由FRET进行分析(T型0)或回到中等水平,内化20分钟(T 20分钟)或使用10−5 聚乙烯(T 20分钟+体育课)在FRET测量之前。仅用pECFP-N1载体转染的细胞作为阴性对照,有关详细信息,请参阅“实验程序”A类,表达HA的活细胞中实时光漂白的示例α1a个-ARs-ECFP,并在感兴趣区域标记CT-B受体(CT-B)(投资回报率,白色虚线框区域)被100%532 nm激光(CT-B)和表面膜内的FRET漂白(白色实心方框区域)通过观察供体(HA)荧光强度的增加进行监测α1a个-ARs-ECFP),因为向受体(CT-B)的转移减少。B类,三个独立实验中不同荧光团对的平均FRET值。每个实验都会对20到30个细胞进行光漂白。值代表三个独立实验的平均±S.E(n个= 3).C类,表达HA的细胞FRET值的分布α1a个-AR-ECFP并用CT-B标记,表明FRET在激动剂刺激后转移到较低水平。漂白电池总数(n个)如图图例所示。
图4
图4。西方分析表明α1a个AR、Gq个和其他G蛋白占据类似的筏环境
使用慢速(A类)或快速(B类)用抗膜蛋白和raft蛋白的抗体分析抽提物。HA的分布-α1a个AR显示在顶部。针对所示蛋白质的抗体在“实验程序”中进行了描述。标记区由.体育课l、 颗粒;提取,摘录。
图5
图5。激动剂刺激α1a个AR导致受体从轻筏转移到中等密度囊泡
A类,在37°C培养基中生长的细胞用10−5 PE,在制备粗筏提取物之前。西方分析显示HA的分布-α1a个AR从灯光切换(分数2)到中等(分数4)密度膜。交替的时间点来自同一天进行的独立实验。B类,相对HA的定量-α1a个轻筏AR密度(分数2)以比率表示的中等密度膜(分数4)(f2/f4)用10进行治疗−5 不同时间的PE。通过交叉分析测定相对浓度,如图2所示,但馏分4被连续稀释,因此两次装载的馏分2样品在稀释系列的范围内。筏提取物是从两天内进行的四个独立的时间过程中制备的。C类,表面HA-α1a个在用10−5 不同时间的PE。4次化验中的两次与上述筏式制剂同时进行,两次在相邻的几天进行。数值表示为平均值±S.E(n个= 4).
图6
图6。胆固醇消耗减少表面α1a个AR可能通过网格蛋白介导的内化
A类、HA-α1a个在37°C培养基中生长的AR表达细胞在用甲醛固定之前,用不同浓度的MCD处理指定的时间。使用3F10-HRP测定相对表面受体水平,如“实验程序”所述B类,孵育1小时±5米MCD,细胞再培养1 h±10−5 表面HA测定前PE-α1a个AR级别。C类MCD通过网格蛋白凹坑对Tnf内化的影响。添加125将I-Tnf注入37°C的培养基中,然后进行30分钟的培养、清洗和内化标记的定量。通过减去背景值(<样品值的15%)获得最终值,通过加入200倍过量的冷转铁蛋白进行估算。数值表示为平均值±S.E(n个=3)用于表面分析,平均值±S.D(n个=3)用于Tnf内化分析。
图7
图7。直接证据表明α1a个AR通过氯氰菊酯涂层凹坑内化
稳定表达HA的Rat-1细胞-α1a个将EGFP标记的网格蛋白轻链瞬时转染AR,以鉴定网格蛋白凹坑。在4°C下用3F10标记活细胞(A类)或在37°C下返回培养基1小时(B类C类)固定之前。在这两种情况下,细胞都被渗透,3F10标记有Alexa Fluor 647-共轭山羊抗鼠IgG次级(显示为红色). 合成图像(面板iii)强调表面标记细胞中受体与氯氰菊酯凹坑缺乏共定位(A类)受体内化细胞凹坑中存在受体(B类C类). 含有HA的可能的网格蛋白坑簇-α1a个应收账款(B类,面板i–iii)显示了(箭头),以及扩大的装箱区(C类,面板i–iii).

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