PKD1, PKD2, and their substrate Kidins220 regulate neurotensin secretion in the BON human endocrine cell line

doi:10.1074/jbc.M707513200

.2008年2月1日；283(5):2614-21.

doi:10.1074/jbc。M707513200。 Epub 2007年11月29日。

PKD1、PKD2及其底物Kidins220调节BON人内分泌细胞系中神经降压素的分泌

李静（音译）¹, L安迪·陈, 小考特尼·M·汤森, B马克·埃弗斯

附属公司

采购管理信息： 18048355
PMCID公司： PMC2427157型
内政部： 10.1074/jbc。M707513200型

PKD1、PKD2及其底物Kidins220调节BON人内分泌细胞系中神经降压素的分泌

李静（音译）等。生物化学杂志. 2008.

.2008年2月1日；283(5):2614-21.

doi:10.1074/jbc。M707513200。 Epub 2007年11月29日。

作者

李静（音译）¹, L安迪·陈, 小考特尼·M·汤森, B马克·埃弗斯

附属

¹德克萨斯大学医学分院外科和西利癌症细胞生物学中心，地址：301 University Boulevard，Galveston，TX 77555，USA。

采购管理信息： 18048355
PMCID公司： PMC2427157型
内政部： 10.1074/jbc。M707513200型

摘要

神经紧张素（NT）是一种肠肽，在胃肠道分泌、运动、生长以及NT受体阳性肿瘤的增殖中起着重要作用。蛋白激酶D（PKD）家族成员（PKD1、2和3）已被确定为跨高尔基网络分泌转运的重要调节因子；然而，机制并不完全清楚。在这里，我们表明，Kidins220是神经内分泌细胞中PKD蛋白的底物，定位于BON细胞过程的末端，类似于NT小泡的表达模式，并易位到膜和对佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐处理形成的大泡状结构。靶向Kidins220的短发夹RNA抑制亲代BON细胞或稳定表达胃泌素释放肽受体的BON细胞中的NT分泌，该受体分别经佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐或蛙皮素处理。此外，我们证明内源性PKD1、PKD2和Kidins220与含NT的小泡共存。激酶头PKD1的过度表达消除了Kidins220的表达和NT小泡的形成。我们的数据建立了PKD/Kidins220通路和含有NT的囊泡之间的生理联系，并表明了该通路在激素分泌调节中的作用。由于NT是一种重要的肠道激素，它影响分泌、炎症以及正常和肿瘤细胞的生长，我们的研究结果确定了一种新的信号通路，可能适合临床应用的药物靶向。

PubMed免责声明

数字

**图1。激酶死亡PKD2减少NT分泌**
**答：。**从BON细胞中提取总RNA，并使用PKD1、PKD2和PKD3基因探针（分别为PRKD1、PRKD2和PRKD3）进行实时RT-PCR，并按照“实验程序”进行分析。实验至少进行了三次。B类用激酶死亡的PKD2和PKD1瞬时转染BON细胞24小时，并用测定的PMA和NT分泌进行处理（上图）。(*,*P（P）*<0.05 vs控制空载矢量；†，*P（P）*<0.05 vs.对照空载体加PMA；n=6）。用抗GST抗体对细胞进行裂解和Western blotting分析（底部）。实验至少进行了三次。C类. (*左侧面板）*用BBS（0、1、10和100nM）处理BON/GFP-GRPR细胞1h，测定NT分泌；(*右侧面板*)用BBS或PMA处理亲代BON细胞，并测量NT分泌。（*，与对照组相比，p<0.05，n=6）。实验至少进行了三次。D类用激酶死亡的PKD1和PKD2瞬时转染BON/GFP-GRPR细胞24小时，并用BBS（10 nM）和NT分泌测定（顶部）处理。(*,*P（P）*<0.05 vs控制空载矢量；†，*P（P）*<0.05 vs.对照空载体加BBS；n=6）。用抗GST抗体进行细胞裂解和Western blotting分析；β-actin作为负荷控制（底部）。实验至少进行了三次。

**图2。静止和活化BON细胞中PKD1和PKD2的表达**
将BON细胞接种在24孔板的盖玻片上，培养48小时。细胞经PMA处理或不经PMA的处理后固定。用抗PKD1（左）、PKD2（中）或NT（右）抗体进行免疫染色。共聚焦显微镜分析表达模式。实验至少进行了三次。

**图3。PKD1和PKD2在BON细胞中优先与NT小泡共定位，而不是TGN或ER**
**BON细胞**在24孔板的盖玻片上镀上，生长48小时。进行免疫染色和共聚焦显微镜分析。使用PKD1抗体进行双重染色(A类)或PKD2(B类)合并图像中的箭头显示彩色化；用PKD1抗体对BON/GFP-NT细胞进行染色。PKD1和NT的彩色化在合并图像中显示为箭头(C类). 实验至少进行了三次。

**图4。Kidins220与NT小泡部分共定位**
**答：。**将BON细胞接种在24孔板的盖玻片上并生长48 h。细胞在没有（a）或PMA（b）、FSK（c）或PGE2（d）的情况下处理。用抗Kidins220抗体进行免疫染色。实验至少进行了三次。B类将BON/GFP-NT细胞接种在24孔板的盖玻片上，培养48小时。用抗Kidins220抗体进行免疫染色并进行共聚焦显微镜分析。实验至少进行了三次。

**图5。PKD1和PKD2调节Kidins220和NT小泡的存在**
**答：。**BON/GFP-PKD1WT细胞（左面板）用抗Kidins220抗体染色（中面板），并进行共聚焦显微镜分析。未发现PKD1WT和Kidins220的共定位（右图）。B类在PMA（100 nM）存在下，GFP-PKD1WT（左面板）和Kidins220（中面板）形成了大的囊泡状结构。GFP-PKD1WT和Kidins220存在于同一囊泡中（右侧面板）。实验至少进行了三次。**C、。**用GST标记的PKD2（a）瞬时转染BON细胞，并用PMA（100nM）处理30分钟。细胞用抗Kidins220抗体（b）染色。GST-PKD2和Kidins220在相同的囊泡中共定位（c和d）。通过共焦显微镜观察图像。实验至少进行了三次。D.BON/GFP-PKD1KD细胞（a）用抗Kidins220抗体（b）染色，并进行共聚焦显微镜分析。在表达GFP-PKD1KD（d，箭头）的细胞中未检测到Kidins220的表达，但在不表达GFP-PKD1KD的细胞中（d，箭头）。E。用NT抗体（b）对BON/GFP-PKD1KD细胞（a）进行染色。共聚焦显微镜分析。在过度表达GFP-PKD1KD（d，箭头）的细胞中未检测到NT小泡，但在不表达GFP-PKD1KD的细胞中检测到NT小泡（d，箭头）。实验至少进行了三次。

**图6。Kidins220介导PMA和BBS刺激的NT分泌**
**答：。**用增加浓度的PMA处理BON细胞30分钟，并进行Western blot。实验至少进行了三次。B类瞬时转染Kidins220 shRNA1（sh1）或shRNA2（sh2）的BON细胞。转染后24小时，用PMA（10 nM）处理细胞30分钟，并测量NT分泌（顶面板）。(*,*P（P）*<0.05 vs控制矢量；†，*P（P）*<0.05 vs.控制矢量加PMA；n=6）。Western blot显示Kidins220表达减少（底部面板）。实验至少进行了三次。C类用Kidins220 shRNA1和shRNA2瞬时转染BON/GRP-GRPR细胞。转染细胞24小时后用BBS（10 nM）处理细胞1小时，并测量NT分泌（顶面板）。(*,*P（P）*<0.05 vs控制矢量；†，*P（P）*<0.05 vs.控制矢量加BBS；n=6）。蛋白质印迹分析显示Kidins220的表达降低（下图）。实验至少进行了三次。

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