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.2008年1月；28(2):836-48.
doi:10.1128/MCB.01088-07。 Epub 2007年11月12日。

协调表观遗传控制和转录干扰以实现组织特异性表达的小鼠基因

亚历山德拉·C·拉卡内利 1, 菲奥娜·B·特纳, 谢林英, 雪莉·M·泰勒, 理查德·莫兰
附属机构

协调表观遗传控制和转录干扰以实现组织特异性表达的小鼠基因

亚历山德拉·C·拉卡内利等。 分子细胞生物学. 2008年1月.

摘要

小鼠fpgs基因使用两个距离较远的启动子以组织特异模式产生功能不同的同工酶。我们询问了P1和P2启动子是如何被差异控制的。CpG-sparse P1启动子的DNA甲基化仅发生在未在该位点启动转录的组织中。P2启动子嵌入CpG岛，根据几个标准，包括DNA甲基化缺乏，似乎对所有组织的转录开放，但仅用于分裂组织。两个启动子上的组蛋白修饰模式非常不同：在P1上，组蛋白激活标记（乙酰化组蛋白H3和H4以及在K4处三甲基化的H3）反映了转录活性，并明显增强了低甲基化CpG的作用；在P2以上，无论P2是活性的、非活性的，还是参与无效启动复合物的组装，这些标记都存在于组织中。由于P1转录活性与P2沉默共存，我们寻求这种转录干扰的机制。我们发现RNA聚合酶II以与转录延伸一致的模式磷酸化，并且在肝脏中只有最低水平的P2以上的起始因子。我们得出结论，小鼠fpgs利用DNA甲基化来控制CpG-sparse启动子的组织特异性表达，该启动子在下游启动子上占主导地位，下游启动子被启动子阻断。

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图1。
图1。
两只小鼠的转录起始位点映射英尺/加仑发起人。（A） 鼠标地图光纤光栅显示外显子A1a、A1b和1（填充框）在两个相邻的HindIII片段上的位置的位点。（B） 利用来自DBA-2小鼠肝脏、L1210培养细胞和L1210原代（1°）白血病细胞的mRNA，通过RPA测定P1和P2启动子的转录起始位点。第一条和最后一条泳道显示末端标记的DNA分子量标记。生成了四个RNA标准，以精确测定数据通道中受保护片段的大小：在标准通道1和3中，P1和P2探针与每个探针的体外转录义补体杂交后，分别得到285 nt和206 nt的受保护片段。在标准通道2中添加173 nt的保护片段，代表外显子A1a和A1b从nt−53到nt+120的序列（相对于外显子A1 b中的第一个翻译起始位点）；在标准巷4中是120nt的保护片段，代表外显子1从nt+19到nt+138的序列（相对于外显子一的第一个翻译起始位点）。下图中的箭头表示图中绘制的转录起始位点的位置；主要（粗体）和次要转录起始位点位于外显子A1a和A1b以及外显子1序列中。
图2。
图2。
小鼠的染色质密度英尺/加仑轨迹。（A） 一个显著的DNase I超敏位点仅存在于启动子激活的组织中的P1区域；在表达组织和非表达组织中，DNase I可以访问P2区域。在25°C条件下，用增加浓度的DNase I孵育细胞核5分钟。提取基因组DNA，用HindIII消化，并在琼脂糖凝胶上运行。用PCR生成的序列在HindIII片段的5′端（下图中的星号）探测印迹。控制通道中的条带表明全长HindIII片段的凝胶流动性。DNase I超敏位点（HS）的位置和包含此类位点的组织如下图所示。（B） 组蛋白H3水平的ChIP测定英尺/加仑基因。来自小鼠肝脏（三角形）、大脑（方形）或L1210白血病细胞（圆形）的染色质与pan-H3抗体（填充符号）或非特异性IgG（开放符号）交联、声波和免疫沉淀。不同片段的DNA含量英尺/加仑使用间隔250至300 nt的引物通过实时PCR确定位点；符号放在每个PCR片段的中间。输入表示0.1%原料的放大产物。两个DNase超敏位点的位置显示为交叉阴影条。本图和所有后续ChIP图中的实验至少进行了两次，数据来自一个具有代表性的实验。
图3。
图3。
H3Ac和H4Ac沿英尺/加仑表达来自P1或P2的转录物的小鼠组织中的基因座。来自L1210白血病细胞（A）、小鼠肝脏（B）和小鼠大脑（C）的染色质与抗H3Ac、H4Ac或非特异性IgG（开放符号）的抗体交联、超声和免疫沉淀。不同片段的DNA含量光纤光栅如图2B的图例所示，通过实时PCR测定该位点。两个DNase超敏位点的位置显示为交叉阴影条。α、 反。
图4。
图4。
小鼠区域的CpG甲基化英尺/加仑各种组织中的启动子。P1启动子区CpG甲基化与转录活性相关；无论激活与否，P2启动子区都是非甲基化的。基因组DNA经5M亚硫酸氢钠处理，PCR扩增，克隆，并测定每个区域10个克隆的序列。在基因组序列中每个CpG二核苷酸的位置，含有甲基化胞嘧啶的克隆的百分比在图中表示，并相对于外显子A1a、A1b和1的位置绘制（填充框）。
图5：。
图5：。
组蛋白H3在赖氨酸4或27处甲基化的分布英尺/加仑表达P1（肝脏）、P2（L1210）或两个启动子（大脑）转录物的小鼠组织中的位点。来自L1210细胞（A和D）、小鼠肝脏（B和E）和小鼠大脑（C和F）的染色质通过抗H3K4me3（A、B和C）或抗H3K27me1、H3K27me2或H3K17me3（D、E和F）抗体交联、声波和免疫沉淀。在面板A上为面板A、B和C定义闭合符号，在面板D上为面板D、E和F定义闭合符号。对于每个免疫沉淀，使用单独的非特异性IgG对照物（开放符号）；在面板D、E和F中，IgG数据绘制在更敏感的纵坐标上。不同片段的DNA含量英尺/加仑如图2B的图例所示，通过实时PCR测定该位点。两个DNase超敏位点的位置显示为交叉阴影条。
图6。
图6。
H3K36me3沿英尺/加仑小鼠组织中的位点。（A） 来自小鼠肝脏、小鼠大脑和小鼠L1210白血病细胞的染色质用抗H3K36me3或IgG的抗体（开放符号）交联、超声处理和免疫沉淀。不同片段的DNA含量英尺/加仑如图2B图例所示，通过实时PCR确定基因座。两个DNase超敏位点的位置显示为交叉阴影条。（B） H3K36me3的ChIP信号与总组蛋白H3的比率。H3K36me3的量表示为总组蛋白H3的ChIP信号比率，以确定面板a中H3K365me3信号的最小值是否反映了区域核小体上H3K36的总H3密度或甲基化缺失。
图7。
图7。
RNAPII对两只小鼠片段的驻留性英尺/加仑小鼠肝脏和L1210细胞中的启动子。（A） 沿着英尺/加仑如图2B图例所示，通过实时PCR对RNAPII抗体免疫沉淀的基因进行定量。P1的位置绘制为0 kb，P2在横坐标上绘制为10 kb。在B组中，使用相同抗体的ChIP对P1和P2周围的DNA区域进行了精细定位。非特异性结合通过免疫沉淀法测定肝脏（开放三角形）和L1210（开放圆形）中的IgG。对于面板B中的P1图，面板A中绘制为0的引物集也绘制为0。面板A中打印为10 kb的引物集中绘制为面板B中P2图的0。数据绘制在面板B中每个放大区域的中点。
图8。
图8。
P2片段上检测到丝氨酸2和5处RNAPII的磷酸化英尺/加仑启动子。ChIP行走研究使用抗RNAPII抗体（pan-RNAPII）、抗丝氨酸2和丝氨酸5处RNAPII磷酸化（P）的CTD七肽（YSPTSPS）重复序列的抗体以及抗IgG的抗体作为非特异性对照进行。在P1和P2上扩增了五到六个片段英尺/加仑分别是发起人。如图2B图例所示，使用实时PCR进行定量。数据点绘制在每个放大区域的中点。所有面板的符号均符合面板Aα，anti。
图9：。
图9：。
小鼠体内存在转录因子英尺/加仑L1210细胞、肝脏和大脑中的P2启动子。使用针对序列特异性转录因子Sp1和一般转录因子TFIIB、TBP、TAFp250和NELF-A蛋白的抗体进行ChIP分析。使用与P2转录起始位点相关的−379和−119处的引物，通过实时PCR进行定量。
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