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比较研究
.2008年2月；104（4）:1065-80。
doi:10.1111/j.1471-4159.2007.05031.x。 Epub 2007年11月6日。

阿尔茨海默病中的信号转导：p21活化激酶信号需要在Asp664处APP的C末端断裂

Thuy-Vi V Nguyen公司 1, 维罗妮卡·加尔文, 魏黄, 苏里塔·班韦, 惠东汤, 张俊丽, Dale E Bredeson公司
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比较研究

阿尔茨海默病中的信号转导：p21活化激酶信号需要在Asp664处APP的C末端断裂

Thuy-Vi V Nguyen公司等。 神经化学杂志. 2008年2月.

摘要

阿尔茨海默病（AD）的缺陷至少部分源于淀粉样前体蛋白（APP）产生的神经毒性β-淀粉样肽。APP也可能在Asp664处被细胞内裂解，产生第二个神经毒性肽C31。之前，我们通过比较AD模型动物的疾病因素，以及血小板衍生生长因子B链启动子驱动的APP转基因小鼠（PDAPP）和无功能性天冬氨酸664半胱天冬酶裂解位点（PDAPP D664A）的情况，表明APP转基因鼠的损伤需要C末端的APP裂解。然而，Asp664导致这些缺陷的信号机制仍有待阐明。在这项研究中，我们发现了一种激酶蛋白，最近显示其在C末端结合APP并参与AD，其活性在PDAPP小鼠中被修饰，但在PDAPP D664A小鼠中正常化。具体而言，我们观察到，与非转基因同窝出生的PDAPP小鼠相比，3个月大的PDAPP小鼠海马中的核p21活化激酶（亚型1、2和或3；PAK-1/2/3）活化显著增加，这种作用在PDAPP D664A小鼠中完全被阻止。相比之下，13个月大的PDAPP小鼠PAK-1/2/3活性显著下降，而PDAPP D664A小鼠PAK-1/2活性再次下降。同样，与正常对照组相比，早期和重度AD受试者的海马区PAK-1/2/3活性进行性和亚细胞特异性降低。有趣的是，PAK-1/2/3总蛋白在早期AD受试者中增加，但在中度AD中下降，在重度AD中进一步下降，显著低于对照水平。这些发现与之前的建议一致，即PAK可能参与AD的病理生理学，并证明小鼠AD模型中的早期激活和晚期失活都需要在Asp664处裂解APP。

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图1
图1
PDAPP D664A小鼠可阻止3个月龄PDAPP小鼠海马中PAK-1/2/3活化增加。（a） 非转基因（非Tg）同胞、PDAPP【J20线，PDAPP（J20）】转基因和在Asp664【B254线，PDAPP D664A（B254）】转基因突变的PDAPP；B21线，PDAPI D664A（B21）】转基因脑切片的海马CA1神经元用抗磷酸化特异性PAK-1/2/3（Ser141）抗体或兔IgG对照进行免疫染色，随后是Alexa Fluor488抗兔二级（绿色）。DAPI染色显示细胞核，伪彩色红色。典型图像(n个每组≥6只动物），使用40倍物镜和2倍（顶面板）或4倍（底面板）变焦在激光扫描共聚焦显微镜上拍摄。比例尺：10μm。（b） 使用总PAK-1/2/3（61kDa PAK-2，68kDa PA K-1/3）抗体，通过western blot检测非Tg、PDAPP（J20）、PDAPP D664A（B254）和PDAPP D664A（B21）大脑海马提取物共40μg。图中的免疫印迹是具有代表性的实验(n个=每组6只动物）。
图2
图2
3月龄PDAPP和PDAPP D664A小鼠海马亚区PAK-1/2/3活化的定量分析。使用磷酸化特异性PAK-1/2/3（Ser141）抗体或兔IgG对照物对非转基因（非Tg）同窝鼠、PDAPP【J20线，PDAPP（J20）】转基因和在Asp664【B254线，PDAPP D664A（B254）；B21线，PDPPP D664（B21）】转基因处突变的PDAPP脑切片的海马神经元进行免疫染色，其次是Alexa Fluor488二级抗兔药物（绿色）。用假彩色DAPI染色观察细胞核。通过处理激光扫描共聚焦显微镜图像，获得CA1、CA2、CA3和齿状回分子层（MLDG）中磷酸-PAK-1/2/3或DAPI免疫反应神经元的计数，然后使用Bitplane Imaris Suite中的Spots模块进行量化。（a） 面板显示有代表性的图像(n个每组≥6只动物）对磷酸化PAK-1/2/3免疫反应神经元进行斑点计数。放大倍数=80×，比例尺：10μm。（b） 图表显示了各组（CA1：F类= 28.7; df 3,44；第页< 0.0001; CA2：F类= 33.3; df3,44；第页< 0.0001; CA3：F类= 33.8; df 3,44；第页< 0.0001; MLDG：F类= 12.6; df 3,44；第页< 0.0001; 海马：F类= 84.7; df 3188；第页<0.0001）的组合图像(n个每组≥6只动物）。磷蛋白PAK免疫反应用图形表示为阳性磷蛋白PAK-1/2/3染色神经元数量与阳性DAPI染色神经元数量的百分比，其显著性的表示来自汇总原始数据的统计分析。使用Newman-Keuls检验分析组间比较：*第页与非Tg组相比<0.05，#第页与PDAPP（J20）组相比，<0.05。
图3
图3
在PDAPP D664A小鼠中，防止了13个月大的PDAPP小鼠海马中PAK-1/2/3激活的降低。（a） 用磷酸化PAK-1/2/3（Ser141）抗体或兔IgG对照物免疫染色非转基因（非Tg）同窝鼠、PDAPP【J20线，PDAPP（J20）】转基因和在Asp664【B254线，PDAPP D664A（B254）】转基因突变的PDAPP脑切片的海马CA1神经元，其次是Alexa Fluor488二级抗兔药物（绿色）。DAPI染色显示细胞核，伪彩色红色。典型图像(n个每组≥6只动物），使用40倍物镜和2倍（顶面板）或4倍（底面板）变焦在激光扫描共聚焦显微镜上拍摄。比例尺：10μm。（a） 使用总PAK-1/2/3（61kDa-PAK-2和68kDa-PHK-1/3）抗体通过western blot检测非Tg、PDAPP（J20）和PDAPP D664A（B254）大脑海马提取物各40μg。图中的免疫印迹是具有代表性的实验(n个=每组6只动物）。
图4
图4
13月龄PDAPP和PDAPP D664A小鼠海马亚区PAK-1/2/3活化的定量分析。用磷酸化PAK-1/2/3（Ser141）抗体或兔IgG对照抗体对来自非转基因（非Tg）同窝配偶、PDAPP【J20线，PDAPP（J20）】转基因和在Asp664【B254线，PDAPP D664A（B254）】转基因突变的PDAPP脑切片的海马神经元进行免疫染色，然后用Alexa Fluor488二级抗兔抗体（绿色）进行免疫染色DAPI染色显示细胞核，伪红色。通过激光扫描共聚焦显微镜图像处理，获得CA1、CA2、CA3和齿状回分子层（MLDG）中磷酸化PAK-1/2/3或DAPI免疫阳性神经元的计数，然后使用Bitplane Imaris Suite中的软件Spots模块进行量化。图表显示了各组（CA1：F类= 5.3; df 2,33；第页= 0.0101; CA2：F类= 9.8; df 2,33；第页= 0.0005; CA3：F类= 4.8; df 2,33；第页= 0.0146; MLDG：F类= 8.0; df 2,33；第页=0.0022；海马：F类= 16.2; df 2132；第页<0.0001）的组合图像(n个每组≥6只动物）。磷蛋白PAK免疫反应用图形表示为阳性磷蛋白PAK-1/2/3染色神经元数量与阳性DAPI染色神经元数量的百分比，其显著性的表示来自汇总原始数据的统计分析。使用Newman-Keuls检验分析组间比较：*第页与非Tg组相比<0.05，#第页相对于PDAPP（J20）组，<0.05。
图5
图5
PDAPP D664A小鼠可防止PDAPP小鼠大脑中Thr423、Thr402和Thr421处PAK-1/2/3的异常激活。使用磷酸化PAK-1（Thr423）/PAK-2（Thr402）（61-67 kDa磷酸化PAK-2，68-74 kDa磷酸盐-PAK-1/3；顶部免疫印迹）和总PAK-1/2/3（61 kDa PAK-2，68 kDa PA K-1/3；底部免疫印迹抗体。顶部和中间面板显示有代表性的免疫印迹，底部面板显示各组（3个月：F类= 3.9; df 2,29；第页= 0.0321; 13个月：F类= 4.2; df 2,30；第页=0.0242）联合免疫印迹(n个每组≥10只动物）。磷酸化PAK-1/2/3密度测定以磷酸化蛋白与总蛋白比率的百分比表示，并表示从汇总原始数据的统计分析中获得的显著性。使用Newman-Keuls检验分析组间比较：*第页与非Tg组相比<0.05，#第页与PDAPP（J20）组相比，<0.05。
图6
图6
早期、中度和重度阿尔茨海默病（AD）患者海马中PAK-1/2/3激活和表达的选择性变化。（a） 对年龄匹配的正常（对照）、早期AD和严重AD受试者的脑组织进行尸检，并用磷酸化PAK-1/2/3（Ser141）抗体或兔IgG对照进行免疫染色，然后用Alexa Fluor488二级抗兔抗体（绿色）进行免疫染色。DAPI染色显示细胞核，伪彩色红色。典型图像(n个使用40倍物镜和2倍（顶面板）或4倍（中面板）变焦，在激光扫描共聚焦显微镜上捕获锥体海马神经元（每组8例）。底部面板显示40倍物镜和2倍缩放下用磷酸化PAK-1/2/3（绿色）、PDI（或小鼠IgG对照；红色）和DAPI（蓝色）染色的神经元。比例尺：10μm。（b） 使用总PAK-1/2/3（61 kDa PAK-2，68 kDa PA K-1/3；顶部免疫印迹）和GAPDH（36 kDa；底部免疫印迹。顶部和中间面板显示有代表性的免疫印迹，底部面板显示各组的平均密度值（±SEM）(F类= 6.3; df 3,24；第页=0.0027）的联合免疫印迹(n个=每组7例人类病例）。PAK-1/2/3密度测定以PAK与GAPDH之比的百分比表示，并表示从汇总原始数据的统计分析中获得的显著性。使用Newman-Keuls检验分析组间比较：*第页与正常病例相比<0.05。
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