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.2007年8月27日；178(5):785-98.
doi:10.1083/jcb.200704108。

Sun1与核孔复合物的功能结合

刘谦（音） 1, 耐莉长裤, 汤姆·米斯特利, 穆罕默德·埃尔萨加, 梅丽莎·克里斯普, 迪迪埃·霍季奇, 布莱恩·伯克, 凯尔·J·鲁
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Sun1与核孔复合物的功能缔合

刘谦（音）等。 J细胞生物学. .

摘要

Sun1和2是A型层粘连蛋白，与nesprins结合，在哺乳动物核膜的内核膜（INM）和外核膜之间形成连接。免疫荧光和免疫电子显微镜显示，Sun1而不是Sun2与核孔复合体（NPC）密切相关。拓扑分析表明Sun1是INM的II型整合蛋白。Sun1在INM中的定位由其核质结构域中的至少两个离散区域定义。然而，与NPC的关联依赖于核质域和管腔域的协同作用。RNA干扰导致Sun1缺失或过度表达显性负Sun1片段的细胞表现出NPC聚集。这意味着Sun1是核表面NPC分布的重要决定因素。

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数字

图1。
图1。
哺乳动物SUN蛋白家族。Sun1具有四个疏水性序列H1–H4，每个约有20个氨基酸残基。其跨膜结构域包含在H2–H4区域。Sun1 N末端，包括H1，是核质的。C终端SUN域位于PNS中。小鼠而非灵长类动物Sun1含有预测的C2H2锌指。已确定小鼠Sun1的几个剪接亚型具有外显子6-8（包括H1）编码序列丢失的特征。相应的GenBank/EMBL/DDBJ登录号为BAB29445（Sun1Δ6–8）、AAT90501（SunlΔ6）和BAC29339（Sun 1Δ8）。已知其他四种哺乳动物SUN蛋白。Sun2广泛表达并定位于INM。Sun3（SUNC1）、Sun4（SPAG4）和Sun5（SPAG4L；GenBank/EMBL/DDBJ登录号NP_542406）似乎主要在睾丸中表达（未公布的数据）。当以HeLa细胞表达时，Sun3定位于NE（图S2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200704108/DC1)而Sun4（Hasan et al.，2006）和Sun5（未发布的数据）主要定位于ER。
图2。
图2。
Sun1和2在NE的平面内被分离。使用抗核蛋白和抗SUN蛋白抗体对稳定表达小鼠Sun1-GFP或人Sun2-GFP的HeLa细胞进行免疫荧光显微镜检查。（A） 核表面的图像显示Sun1-GFP与Nup153共定位。相反，无NPC区域的Sun2-GFP扩散更大。内源性Sun2与标记有抗核蛋白抗体QE5或Sun1-GFP的NPC均无共定位。顶部面板中的方框区域在底部三个面板中被放大。（B） 在后期晚期到末期早期，重整核显示出NPC和NE成分的明显分布。Sun1-GFP定位于新分离的染色单体的侧缘，Nup153在Sun2-阳性核心区缺失。这些数据表明，Sun1与NPC密切相关，这种模式在NE形成早期建立。棒材（A），5μm；（B） 4微米。
图3。
图3。
免疫电镜显示，Sun1而不是Sun2与NPC密切相关。（A） 四环素诱导HeLa细胞表达Sun1-GFP的NPC横截面图显示，NPC附近存在抗GFP相关的金颗粒。（B） 未诱导细胞的切片显示很少或没有金标记。（C） 表达Sun2-GFP的HeLa细胞NE横截面图像显示PNS中的金颗粒，但与NPC没有优先关联。c、 细胞质；n、 核心。箭头表示金颗粒。（D和E）定量分析表达Sun1-（D）或Sun2-GFP（E）的HeLa细胞NE横截面上的金颗粒分布。金粒子的位置由水平距离（从NPC八倍轴）和垂直距离（从NE中心平面）定义，在横截面NE中测量（如A和C），并在单点图形中绘制。提供显微照片作为金颗粒位置的视觉参考。相邻面板上显示了水平和垂直距离的金颗粒分布直方图。对于Sun1和Sun2，每个NPC两侧200和600纳米窗户内的金颗粒都被打分。更大、更保守的窗口尺寸仍然显示，在NPC中心120 nm范围内，Sun1的标记密度比Sun2高出八倍，峰值密度为66 nm。共有88个和92个金颗粒分别为D和E打分。由于Sun2-GFP的分布范围要广得多，因此E的刻度是D.Bars的五倍，即100 nm。
图4。
图4。
Sun1包含单个TM域。（A） 三个Sun1突变体包含N末端结构域，随后是H2、H2-H3和H2-H4，在N末端用HA标记，在C末端用GFP标记，然后是myc表位。用这些构建体转染（或未转染[NT]）的HeLa细胞用[35S] Met/Cys用洋地黄素渗透，用蛋白酶K孵育。SDS裂解、抗myc免疫沉淀和SDS-PAGE分析后，只有Sun1N455保留了GFP预测大小的保护片段（～30 kD）。TX-100渗透导致蛋白质完全降解。未转染细胞作为阴性对照，而Sun1-GFP提供阳性对照，带有65–70-kD的保护片段。Western blot分析用于确认洋地黄素渗透的有效性。导管蛋白和层粘连蛋白A/C在洋地黄苷或TX-100透化后降解。相反，内质网管腔蛋白PDI在洋地黄素渗透后保持完整，但在TX-100治疗后降解。（B） 为了进一步确定这些Sun1构建物的方向，转染24小时后，用洋地黄素或TX-100固定HeLa细胞并使其渗透。分析侧重于表达足够高水平重组蛋白的细胞，以便在NE和ER/细胞质膜中都能观察到GFP荧光。随着洋地黄素的渗透，HA-Sun1N380-GFP-myc和HA-Sun1-N415-GFP-myc的myc和HA表位都很容易检测到。相反，HA-Sun1N455-GFP-myc可获得HA而不是C末端myc表位标签。在所有病例中，TX-100通透性后，myc和HA标签都可以被访问。（C） 如A中所述，将另外三个含有前220个Sun1残基的C末端GFP标记的Sun1构建体渗透至H3或H3–H4，以及缺失H2–H3的全长Sun1（分别为Sun1N220H3-GFP、Sun1N220H34-GFP和Sun1ΔH23-GFP），并用抗GFP抗体标记。随着洋地黄素的渗透，H4结构域的存在使得GFP部分无法被抗体所识别。总之，这些结果表明H4是Sun1的唯一TM域。棒材，4μm。
图5。
图5。
Sun1核质结构域具有重叠的NE定位基序。瞬时表达Sun1缺失结构的HeLa细胞的免疫荧光显微镜。（A） Sun1N355是一个先前被鉴定为具有NE定位的区域，根据Sun1的天然剪接亚型（Sun1N355Δ221-343-GFP）进一步突变。这种缺乏H1结构域的蛋白质主要是核质的。包含H2（Sun1N380Δ221–343-GFP）后，其变为NE相关。从NE-localized Sun1N380（myc-Sun1-221–380）中删除N末端220残基无法消除NE定位。然而，将缺失延伸到包括H1（myc-Sun1-261–380）导致ER定位，NE中的浓度很低。（B）为了检查H2–H4在Sun1定位中的作用，H234-GFP在HeLa细胞中表达，其集中在高尔基体中。Sun1的这个区域（H2–H4）被Sun3的TM域（HA-Sun1（S3TM））所取代，导致定位与全长Sun1无法区分。然而，在核质结构域（S3TMSun1L-GFP）缺失后，该蛋白主要存在于高尔基体中。类似地，H234Sun1L（H4Sun1L-GFP）中H2和H3结构域的缺失导致NE与ER定位相关的缺失。Golgi相关S3TMSun1L-GFP的NE定位可以通过向N端添加H2–H3序列（H23（S3TM）Sun1L-GFP）来部分挽救。这些数据确定了Sun1核质结构域的两个重叠区域，即H1–H2和H2–H3，这两个区域足以用于NE靶向。然而，后者仅在TM序列和Sun1管腔结构域中起作用。棒材，5μm。
图6。
图6。
Sun1在体内形成同型低聚物。（A） 为了确定Sun的寡聚状态，将HA-Sun1与Sun1-GFP、Sun1N455-GFP、H234Sun1L-GFP和S3TMSun1L-GFP共转染HeLa细胞。所有样品都标有[35S] Met/Cys，并用抗GFP抗体进行免疫沉淀。全长HA-Sun1与Sun1-GFP共沉淀的效率最高，其次是含有融合蛋白的管腔域，然后是核质域。NT，未转染。（B） Sun1-GFP或HA-Sun1分别与SS-HA-Sun1L-KDEL或S3TMSun1L-GFP共转染，提供了由管腔结构域介导的Sun1齐聚的体内证据。单独地，这些蛋白质主要定位于内质网或高尔基体。全长Sun1的共表达将两种蛋白质募集到NE。因此，Sun1形成同源寡聚体，其独立地涉及管腔，在较小程度上涉及核质结构域。棒材，6μm。
图7。
图7。
Sun1与NPC的结合需要核质和内腔结构域。（A） 为了确定Sun1参与鼻咽癌关联的区域，缺失管腔结构域（Sun1N455-GFP）或核质结构域（H234Sun1L-GFP）的Sun1突变体在HeLa细胞中瞬时表达。Sun1缺失突变体均未与Nup153显示出明显的共定位。（B） 为了进一步分析不同结构域在Sun1靶向和保留中的作用，对Sun1、Sun1N455、Sun1 N380、Sun1A N380Δ221-343、Sun+1 N380△221-355和H234 Sun1L进行了FRAP分析，每个结构域在C末端都带有GFP标签。与全长Sun1-GFP相比，全长Sun1-GFP在NE中相对不动，所有缺失蛋白在～1分钟内都发生了荧光恢复。总之，这些数据表明，是核质和管腔结构域的组合使Sun1在NE稳定，可能与NPC相关。点框定义光漂白区域。棒材，1μm。
图8。
图8。
Sun1扰动影响NPC分布。（A） RNAi去除SUN蛋白48小时后HeLa细胞的免疫荧光显微镜。细胞被抗Sun1或Sun2和Nup153抗体双重标记。Sun1缺失与核形态改变和NPC分布改变有关。核表面的放大显示了NPC簇之间的无孔区。未转染细胞（Sun1对照和Sun2插入物）或Sun2 RNAi没有这种作用。Sun1N455-GFP的表达以类似于Sun1 RNAi的方式改变了NPC的分布。方框区域在右侧面板中放大。（B） 为了量化观察到的NPC分布变化，计算了穿过投影核表面的反Nup153荧光强度的装箱像素强度的相对SD。所有测量均相对于未转染对照组进行了标准化，该对照组被设定为0%。Sun1 RNAi和Sun1N455-GFP在诱导NPC聚集方面最有效，其次是H234Sun1L-GFP、myc-Sun1N220和myc-Sun 1 220–380。SS-HA-Sun1L-KDEL和Sun1-GFP对鼻咽癌分布的影响最小。Lamin C作为转染对照，未诱导明显的NPC聚集。n个= 7–18. （C） 为了量化Sun1 RNAi引起的核形态改变，测量了投射核面积与周长的比值。与对照细胞相比，Sun1的RNAi使该比率降低了35%，而对照细胞被设置为100%。n个= 10–11. 误差棒代表SEM。棒，5μm。
图9。
图9。
Sun1拓扑和交互。（A） Sun1被设想为通过与C末端管腔域内的膜近端螺旋线圈的相互作用形成同二聚体。核质结构域相互作用也可能有助于同源二聚体的形成。Sun1是ONM nesprin蛋白的系链。Nesprins 1和2与肌动蛋白细胞骨架相连，而nesprin 3与多功能细胞连接蛋白plectin结合。（B） Sun1与NPC相关，此外，其核质结构域显示出与新合成的前层粘连蛋白A的优先结合。因此，Sun1可能在NPC和A型层粘连之间提供链接。这样，Sun1介导的A型叶片组件的成核可能发生在NPC处。
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