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.2008年1月;27(1):53-66.
doi:10.1016/j.matbio.2007.07.005。 Epub 2007年7月17日。

泪腺细胞外基质结构降解增加与干燥综合征发病机制有关

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泪腺细胞外基质结构的降解增加与Sjögren综合征的发病机制有关

卡贾·申克-莱兰等。 基质生物. 2008年1月.

摘要

男性非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的泪腺(LG)在自身免疫性疾病舍格伦综合征(SS)患者中表现出人类LG的许多特征,包括分泌功能丧失和4个月大时淋巴细胞浸润到腺体。到目前为止,研究主要集中在启动LG功能障碍的细胞内事件;然而,SS对患病LGs的细胞外基质(ECM)结构的影响尚未确定。在本研究中,我们鉴定并比较了年龄匹配的健康雄性(BALB/c)和患病(NOD)小鼠LG ECM的形成和完整性。采用常规组织学、生化、免疫组化和基因表达分析对LG组织进行检查。多光子成像和二次谐波(SHG)显微镜允许对主要LG ECM结构进行非侵入性分析,包括胶原蛋白和弹性蛋白纤维。生化测试表明,与健康BALB/c LG相比,NOD LG中的胶原蛋白、糖胺聚糖和桥氨酸显著减少。免疫组织化学染色和基因表达分析证实了LG ECM结构的这种疾病相关改变。此外,激光诱导自体荧光和SHG显微镜显示,病变LG组织的大多数胶原纤维和弹性纤维的结构组织发生了显著变化,比组织学分析显示的变化更为显著。我们的结果清楚地表明,ECM蛋白的降解增强,伴随着病变LG组织ECM结构的严重紊乱和变形。这些关于SS中ECM降解参与的新见解可能会为干眼症患者带来新的治疗方法。

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图1
图1
年龄匹配的18(A,B)和24(C,D)周龄BALB/C(A,C)和NOD(B,D)小鼠的LG解剖显微照片。
图2
图2
(A) 7(A)、18(b)和24(c)周龄NOD小鼠LG切片的苏木精-伊红染色显示,随着年龄的增长,腺泡组织持续严重的炎症浸润。(B) 对18周龄BALB/c(a,B)和NOD(c,d)LG进行动五色染色。胶原蛋白=黄色,GAG=蓝绿色,弹性蛋白=深蓝色/黑色,细胞核=深红色。(C)与Hart染色的BALB/C LG切片(a,b)相比,年龄匹配的18周龄NOD小鼠(C,d)的LG组织显示出较少的弹性纤维,导管和血管较少但增大。
图3
图3
生化分析表明,与年龄匹配的BALB/c组织相比,18周龄NOD小鼠LG组织中的ECM蛋白(包括GAG、总胶原蛋白和桥粒蛋白)显著减少。
图4
图4
18周龄NOD小鼠LG的免疫组织化学分析显示大量炎症浸润,主要位于腺泡(a)、血管(bv)和导管(d)周围,与ECM蛋白的空间降解有关。图像显示F-actin染色(红色)和阳性染色(绿色):纤维连接蛋白(A,B);I型胶原(C、D);III型胶原(E、F);IV型胶原(G,H);层粘连蛋白1(I,J);HS-GAG(K,L);花色苷(M,N);和原弹性蛋白(O,P)。DAPI染色显示细胞核(蓝色)。
图5
图5
(A) 年龄匹配(18周)的NOD LG与BALB/c小鼠LG组织的基因表达分析表明,胶原蛋白I、III和IV、层粘连蛋白1和核心蛋白的表达下调,并且NOD LGs中tenascin c的表达增加。未发现弹性蛋白表达有明显变化。(B) 实时RT-PCR分析(*-P(P)BALB/c和NOD LG中Rab3d-表达模式。(C) 免疫组织化学染色显示,在NOD LG组织的炎症区域(a-d与e-h),MMP2和MMP9显著上调。图像显示绿色的MMP2(a,e)、MMP9(b,f)、CD68(c,g)和CD4(d,h)阳性染色;内皮细胞(CD31)呈红色,平滑肌(SMA)呈洋红色(a、b、e、f);以及蓝色的细胞核(DAPI)。(D) 明胶酶活性测定显示,与BALB LG相比,NOD LG中的MMP2/9活性在统计学上显著增加(*-P(P)<0.05与BALB/c)。
图6
图6
炎性浸润的斑点图显示存在明显的(A)巨噬细胞以及嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞;(B) B细胞和(C)T细胞。
图7
图7
(A) 使用740 nm(A,b;弹性蛋白和细胞)和860 nm(c,d;胶原蛋白)两种波长,对18周龄BALB/c和NOD小鼠新鲜解剖、未经处理的LG进行多光子诱导自体荧光成像。图像(e)和(f)代表图像(a;绿色)和(c;红色)以及(b;绿色)与(d;红色)的叠加。请注意,在NOD LG组织中,使用740 nm(b和f(绿色))的波长几乎无法检测到自体荧光。要在860nm处诱导自荧光结构,需要更高的激光功率(d和f(红色))。(B) BALB/c和NOD LGs的自发荧光图像的三维重建显示绿色的弹性纤维和主要细胞,红色的胶原结构。
图8
图8
使用可比较的激光功率和860 nm(ROI 1,红色)和740 nm(LOI 2,绿色)的激发波长对BALB/c(A,B)和NOD(c,D)LG组织进行光谱指纹识别。(A,C)这些图形表示胶原结构的峰值SHG强度(ROI 1,红色),以及相应的lambda叠加图像(B和D)中含弹性纤维和细胞的峰值自体荧光强度(ROI2,绿色),用红色(ROI1)或绿色(ROI 2)十字表示。(B,D)红十字表示胶原蛋白在425nm处发出的蓝色SHG信号。峰值发射波长约为510 nm的绿色信号(绿十字)主要对应于弹性元件。注意异常的、非常微弱的NOD LG SHG信号(C和D),表明大多数胶原纤维的超微结构严重恶化和分解。在NOD组织中几乎没有检测到含有弹性蛋白结构的信号。

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