Yeast NDI1 improves oxidative phosphorylation capacity and increases protection against oxidative stress and cell death in cells carrying a Leber's hereditary optic neuropathy mutation

doi:10.1016/j.bbadis.2007.01.009

.2007年5月；1772(5):533-42.

doi:10.1016/j.bbadis.2007.01.009。 Epub 2007年1月26日。

酵母菌NDI1提高了Leber遗传性视神经病变突变细胞的氧化磷酸化能力，增强了对氧化应激和细胞死亡的保护

Jeong Soon公园¹, 李友芬, 白一栋

附属公司

PMID： 17320357
预防性维修识别码：项目经理1905846
内政部： 10.1016/j.bbadis.2007.01.09

酵母菌NDI1提高了Leber遗传性视神经病变突变细胞的氧化磷酸化能力，增强了对氧化应激和细胞死亡的保护

Jeong Soon公园等。 Biochim生物物理学报. 2007年5月.

.2007年5月；1772（5）：533-42。

doi:10.1016/j.bbadis.2007.01.009。 Epub 2007年1月26日。

作者

Jeong Soon公园¹, 李友芬, 白一栋

附属

¹美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心细胞和结构生物学系，邮编78229。

PMID： 17320357
预防性维修识别码：项目经理1905846
内政部： 2016年10月10日/j.bbadis.2007.01.009

摘要

NADH脱氢酶复合物亚单位ND4基因中的G11778A是Leber遗传性视神经病变（LHON）患者中最常见的原发性突变。编码酿酒酵母内部NADH-醌氧化还原酶的NDI1基因被引入线粒体缺陷人类细胞系Le1.3.1的核基因组，该细胞系携带G11778A突变。在转化细胞系LeNDI1-1和-2中，总的和复杂的I依赖呼吸被完全恢复，并且对复杂的I抑制剂鱼藤酮有很大的抵抗力，这表明NDI1在宿主细胞的电子转移中起主导作用。虽然原始突变体Le1.3.1细胞在含有半乳糖的培养基中生长不良，但转化子在半乳糖培养基中的生长能力完全恢复，尽管ATP生成没有完全恢复。此外，携带G11778A突变的细胞中的氧化应激增加在转化子中得到缓解，表现为活性氧（ROS）水平降低。最后，转化子还表现出对诱导凋亡不敏感，并且对百草枯诱导的细胞死亡表现出更大的抵抗力。结论是，酵母NDI1酶可以提高G11778A突变细胞的氧化磷酸化能力，保护细胞免受氧化应激和细胞死亡。

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数字

图1
**检测*新吉布提国际机场*转染细胞中的基因和mRNA。**（A）使用两组人类线粒体特异性引物对总细胞DNA进行PCR扩增*ND4号机组*基因与酵母*新吉布提国际机场*基因。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。（B）用DNA分析中使用的相同引物对不同细胞的总RNA进行RT-PCR，并用1%琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析。

图2
**Le1.3.1和LeNDI1-1，-2细胞中mtDNA G11778A突变的检测。**位置11778处的G到A转换创建了MaeIII限制站点。野生型的896bp部分*ND4号机组*PCR扩增的基因（A）包含三个MaeIII位点，消化后将在346、255和238bp处产生条带（B）。利用突变的线粒体DNA，255 bp的片段将被进一步切割成131和124 bp的两条较小的带。MaeIII消化产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离。

图3
**143B、Le1.3.1和LeNDI1-1、-2细胞的呼吸测量。**，（A）在完整细胞和用解偶联剂FCCP处理后测量的内源性呼吸。（B）谷氨酸盐/苹果酸盐（G/M）、3-磷酸甘油酯/琥珀酸盐（G-3-P/S）和抗坏血酸盐/TMPD（A/TMPD）驱动的透化细胞中呼吸的复合依赖性活性。（C）透性细胞中呼吸抑制剂鱼藤酮和黄酮对复杂I依赖呼吸的抗性，抗霉素A对复杂III依赖呼吸的耐药性。

图4
**呼吸复合物组装分析。**提取线粒体并在4-13%蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质复合物。用NDUFA9、SDHA、III-core 2、IV-亚基I和V-α亚基复合物抗体进行western blot检测，分别鉴定出复合物I、II、III、IV和V。

图5
**ATP含量分析。**测定143B、Le1.3.1和LeNDI1-1、-2细胞在1×10⁶细胞与荧光素酶检测试剂盒。将细胞与氧化磷酸化抑制剂寡霉素（oligomycin）在37°C、15μg/ml浓度下孵育1小时后，测定对寡霉素有抗性的ATP含量（oligomycin-R）计算方法是从总ATP含量中减去寡霉素敏感部分。进行了四次测量，误差条显示平均值标准误差的2倍。

图6
**在葡萄糖和含半乳糖的DMEM中143B、Le1.3.1和LeNDI1-1、-2细胞的生长能力**.细胞以5×10的速度被镀在多个6孔板上^三在葡萄糖（a）和半乳糖（B）培养基中每天计数7天。

图7
**测定143B、Le1.3.1和LeNDI1-1、-2细胞的活性氧。**用两种不同的方法测量ROS。（A）收集细胞并将其悬浮在含有1μM羧基-H的加载介质中₂-DCFDA。（B）用100nM Mitosox Red试剂标记细胞。所示值为3个独立实验的平均值±SEM。

图8
**细胞凋亡检测。**143B、Le1.3.1和LeNDI1-1，-2细胞与500nM星形孢菌素（A）孵育6小时，或与250μM百草枯（B）孵育48小时的凋亡细胞数百分比。凋亡细胞由DAPI染色细胞的圆形和/或收缩细胞核定义。使用Promega的TUNEL分析试剂盒，通过可视化DNA链的标记缺口末端，分析经500nM Stauroshorine（C）和250mM百草枯（D）处理的143B、Le1.3.1和LeNDI1-1、-2细胞的TUNEL阳性细胞百分比。用500nM staurosporine（E）和250μM paraquat（F）处理后，用caspase-Glo 3/7试剂盒（Promega）测量caspase 3/7的活性。对每个分析进行三次独立测量，误差条显示平均值标准误差的2倍。

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