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.2006年10月17日;45(41):12596-609.
doi:10.1021/bi061011t。

Asp1393在催化、黄素还原、NADP(H)结合、FAD热力学和nNOS黄素蛋白调节中的作用

附属机构

Asp1393在催化、黄素还原、NADP(H)结合、FAD热力学和nNOS黄素蛋白调节中的作用

大卫·W·科纳斯等。 生物化学. .

摘要

一氧化氮合酶(NOS)是一类在生物学中具有重要作用的黄血素酶。神经元NOS的还原酶域(nNOSr)包含一个广泛保守的酸性残基(Asp(1393)),被认为有助于NADPH和FAD之间的氢化物转移。之前我们发现D1393V和D1393N突变降低了全长nNOS中NO合成活性以及血红素和黄素减少率。为了更详细地研究这些结果的机制,我们将D1393V和D1393N替换与截断NADPH-FAD结构域构建(FNR)合并到nNOSr中,并对突变体进行了表征。D1393V nNOSr的细胞色素c还原酶、铁氰化物还原酶和NADPH氧化酶活性显著低于野生型(≥1000x)。D1393N nNOSr还具有较低的还原酶活性(≥10x),但NADPH氧化酶活性高于野生型,其FNR片段也是如此。这两个突变体在FAD和NADP(+)的烟酰胺环之间的相互作用发生改变,NADPH对黄素的还原速度较慢,FAD中点电位发生改变,CaM反应正常,在一例(D1393N)中,O(2)对黄素的氧化速度较快,而NADPH结合对FMN的反应缺乏屏蔽。结果表明,这两个突变体由于两个不同的原因破坏了催化作用。在D1393V nNOSr中,从NADPH到FAD的氢化物转移非常缓慢,因此会影响所有下游电子转移事件。在D1393N nNOSr中,还原黄素被O(2)氧化的增加和FAD半醌的热力学失稳在一定程度上解偶联或限制电子转移,从而抑制下游催化。这些影响部分是由于突变消除(D1393V)或改变(D1393 N)天冬氨酸(1393)的天然侧链氢键性质,并消除其负电荷。

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