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.2006年6月12日；203(6):1519-32.
doi:10.1084/jem.20051210。 Epub 2006年6月5日。

静脉基底膜含有特定的基质蛋白低表达区，作为中性粒细胞迁移的出口点

王世军（Shijun Wang） 1, 马蒂厄·伯努瓦·沃伊辛, 凯伦·拉比, 约翰·丹格菲尔德, 克里斯托夫·谢尔曼, Maxine Tran公司, 帕特里克·H·麦克斯韦, 利迪亚·索罗金, 苏珊·努尔沙格
附属公司

静脉基底膜含有特定的基质蛋白低表达区，作为中性粒细胞迁移的出口点

王世军（Shijun Wang）等。 实验医学杂志. .

摘要

白细胞在体内通过静脉壁迁移的机制尚不清楚。通过使用免疫荧光染色和共焦显微镜，本研究证明在未刺激的小鼠大静脉壁内存在一些区域，其中关键血管基底膜（BM）成分、层粘连蛋白10、IV型胶原和巢蛋白-2（但不包括珍珠糖）的表达显著较低（<60%）在同一血管中检测到的平均表达。这些位点与周细胞之间的间隙密切相关，在迁移的中性粒细胞通过细胞因子刺激的小静脉时，它们优先使用这些位点。虽然中性粒细胞迁移并没有改变细胞外基质蛋白低表达位点的数量/单位面积，但这些区域的大小增大，白细胞介素-1β刺激小静脉中的蛋白质含量降低。这些影响完全依赖于中性粒细胞的存在，似乎涉及中性粒细胞衍生的丝氨酸蛋白酶。此外，获得的证据表明，在体内迁移的中性粒细胞在其细胞表面携带层粘连蛋白。总的来说，通过确定细胞外基质蛋白定位低的区域，确定了中性粒细胞迁移的首选途径，我们已经确定了一种可能的机制，中性粒细胞通过这种机制穿透血管BM，而不会对其复杂的结构造成严重破坏。

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图1。
图1。
基底膜蛋白在未刺激的长管壁中的表达谱：LE区域的鉴定。图中显示了不同基质蛋白免疫染色的未刺激的长肌微血管“半血管”的代表性三维图像。（A） LN-α5链在小动脉（左）和小静脉（右）中的表达（检测层粘连蛋白10），以及相应的强度曲线（下图）。彩色编码显示低强度部位为蓝色，高强度部位为红色。成像小静脉壁中具有代表性的层粘连蛋白10 LE区域用白色圆圈表示。（B） 层粘连蛋白γ1（层粘连素8和10的组成成分）、IV型胶原和巢蛋白-2的表达及其相应的强度分布。每个图像至少代表五个血管/组织（至少n个=每组4只小鼠）。棒材，10μm。
图2。
图2。
层粘连蛋白10LE区域也表达低水平的IV型胶原，但持续表达perlecan。面板显示未刺激的克氏微静脉双重染色，如下所示。（A） 层粘蛋白α5链（检测层粘蛋白10）、IV型胶原和（B）层粘蛋白γ1链（层粘蛋白8和10的组成部分）和珍珠糖。在两个面板中，方框区域中显示的血管段以较高的放大倍数显示（及其相应的图像强度剖面），以更好地说明研究中分子的表达剖面（中间）。同一代表性层粘连蛋白LE位点的位置显示在每个面板的所有四个中间图像中。在每个面板的右侧，显示了血管纬向截面的直方图，穿过选定的层粘连蛋白LE位点，以说明层粘连素LE位点与IV型胶原LE区域（a，右侧）的共定位，以及层粘连蛋白质LE位点（B，右侧）珍珠糖的持续表达。在这些面板中，层粘连蛋白荧光强度（任意单位）以绿色显示，IV型胶原和珍珠糖荧光强度以红色显示。每张图像代表三到五条血管/组织(n个=每组3-4只小鼠）。棒材，10μm。
图3。
图3。
层粘连蛋白10和IV型胶原LE区域与内皮细胞连接和周细胞间隙的定位。为了研究层粘连蛋白10（由抗-LN-α5检测）和IV型胶原LE区域相对于内皮细胞和周细胞的定位，对未刺激的克雷马斯特肌组织进行细胞外基质蛋白和CD31（作为内皮细胞标记物）的双重染色或α-SMA（作为周细胞标记物）。显示的所有图像均来自半船。（A） LN-α5和CD31免疫染色小静脉的典型三维图像。白色环表示选定LE区域的位置，一些表明与内皮细胞连接高度相关。（B） 图表显示了层粘连蛋白10（白色条）和胶原IV（黑色条）LE位点在离其最近的内皮细胞连接处不同距离处的百分比。（C） LN-α5和α-SMA免疫染色小静脉的典型三维图像。白色环表示所选LE区域的位置，清楚地表明其定位与周细胞间隙高度相关。（D） 该图显示了层粘连蛋白10（白色条）和胶原IV（黑色条）LE区域在周细胞间隙不同距离处的百分比。在这些研究中，对每组三到四只小鼠的三到五条血管中总共观察到的650个LE位点进行了分析。（E） LN-α5、α-SMA和CD31的代表性微静脉三重染色显示，表明层粘连蛋白10 LE区域（以环状显示的精选示例）与周细胞间隙和内皮细胞连接高度相关。通过沿着所示的线切割小静脉的横截面（1-μm厚），通过选定的LE区域获得底部面板。这些具有代表性的图像进一步表明，层粘连蛋白10 LE位点与α-SMA阴性区域直接共定位，并且靠近内皮细胞连接处（如高荧光强度的离散区域所示）。棒材，10μm。
图4。
图4。
IL-1β刺激组织中中性粒细胞与内皮细胞连接、层粘连蛋白10网络中的LE位点以及周细胞之间的间隙的关联。（A） 对IL-1β刺激的小鼠乳糜泻组织（50 ng/只小鼠阴囊内注射，4h时间点）进行内皮细胞（EC）标记物CD31（红色）和中性粒细胞标记物MRP-14（白色）的免疫染色。捕获感兴趣的半血管的三维图像，并量化中性粒细胞与不同EC连接（即在三细胞或双细胞连接处发现的）或EC体的关联。该图显示了中性粒细胞在不同位置相对于EC连接的百分比。显示了一张代表性的荧光显微照片，其中中性粒细胞在三-EC连接、双-EC连接和EC体上的位置示例分别用“（1）”、“（2）”和“（3）”表示。图形上相应的条形图使用相同的编号方案进行标记。在这些研究中，共有108个不同距离内的中性粒细胞百分比从其最近的LN-α5 LE位点（顶部）和周细胞间隙（底部）变化。（C） 图像显示了IL-1β刺激组织中微静脉（半血管）的典型荧光显微照片，对层粘连蛋白10（LN-α5链）、α-SMA和MRP-14进行了三重染色。层粘连蛋白LE位点的选定区域如箭头所示。结果来自四到五个血管段/组织(n个=6块提肌）。棒材，10μm。
图5。
图5。
在IL-1β刺激的组织中，中性粒细胞通过层粘连蛋白10 LE位点和周细胞间隙迁移。对IL-1β刺激的小鼠乳糜泻组织（50 ng/只小鼠阴囊内注射，4h反应）进行层粘连蛋白10（LN-α5链）、α-SMA（周细胞标记物）和CD11b（白细胞标志物）的免疫染色，并用共聚焦显微镜进行分析。左边的图像来自整个小静脉沿其纵轴的三维图像的中线光学部分。右侧的图像是通过沿着指示的黄线切割小静脉的横截面获得的。这些具有代表性的图像清楚地显示了层粘连蛋白10 LE位点、周细胞间隙和迁移白细胞的共定位（均用黄色箭头表示）。棒材，10μm。
图6。
图6。
IL-1β刺激组织中层粘连蛋白10和IV型胶原网络中LE位点的平均大小和强度（而非数量/单位面积）以中性粒细胞依赖的方式增加。在腹腔注射IL-1β后的指定时间点，通过活体内显微镜对未经治疗或IL-1β（50 ng/ml小鼠）刺激的小鼠cremaster肌肉中的白细胞牢固粘附和/或迁移反应进行定量。在一些实验中，在对反应进行体内分析后，从小鼠体内解剖组织，并对层粘连蛋白10（LN-α5链）或胶原IV进行免疫染色。扫描小静脉的三维图像，并对密度（数量/单位面积）、面积、，和基质蛋白LE位点的平均荧光强度按照材料和方法中的描述进行测量。（A） 左边的两张图显示了中性粒细胞迁移的时间进程以及未经治疗的组织和IL-1β刺激的组织中LN-α5网络内LE位点的面积。右图显示LE区域的荧光强度平均值（MFI，任意单位）。（B） 图中显示了未经治疗组织和IL-1β刺激指定时期的组织中LN-α5网络内LE位点的面积（左）和密度（右）。（C） 同样，这些图表显示了未经治疗和IL-1β刺激组织中IV型胶原LE位点的面积（左）和密度（右）。（D） 通过注射抗GR1单克隆抗体耗尽小鼠的循环中性粒细胞，并向对照小鼠注射等型匹配的对照单克隆抗体（两种单克隆抗体均为100 mg i.p.）。24小时后，小鼠腹腔注射IL-1β（50 ng/只），4小时后通过活体显微镜定量白细胞粘附和迁移。在体内试验期结束时，分离、固定提睾肌组织，并进行层粘连蛋白10（LN-α5）或IV型胶原的免疫染色，并按照材料和方法中的详细说明量化LE区域的大小和/或强度（MFI）。在所有面板中，共有316–716个LE位点，从三到七个血管段/组织(n个=每组3-4只小鼠）。星号表示IL-1β刺激组织与非刺激组织的反应存在显著差异，*，P<0.05和***，P<0.001。进一步的比较由线#，P<0.05；##，P<0.01；和###，P<0.001。
图7。
图7。
NE在体内外层粘连蛋白破坏中的作用。（A） WT或NE−/−小鼠通过阴囊内（i.s.）途径注射IL-1β（50 ng/只）（对照小鼠未经治疗）。（B） WT或NE−/−给小鼠注射i.s.IL-1β（对照小鼠未经治疗），2小时后向小鼠连续注射特定NE抑制剂ONO-5046或抑肽酶（见给药方案的材料和方法）（对照小鼠接受盐水输注）。在所有实验中，在注射IL-1β后2-4小时（如图所示），通过活体显微镜对cremastic小静脉中的白细胞迁移进行定量，详见材料和方法。在活体试验期结束时，从小鼠身上分离提睾肌，固定，并用抗-LN-α5抗体和/或抗IV型胶原（coll IV）抗体进行免疫染色，并按照材料和方法中的详细说明评估LE区域的大小。在所有面板中，共分析了300–716个LE位点，从3到22个血管段，每组使用3到9只小鼠。与非刺激组织相比，IL-1β刺激组织的反应有显著差异，用星号表示（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001），进一步的比较用交叉阴影线表示（#，P<0.05，##，P<0.01，和###，P<0.001）。（C） 使用96周的NeuroProbe趋化室研究中性粒细胞通过层粘连蛋白-1涂层过滤器的迁移，详见材料和方法。简而言之，将骨髓衍生的小鼠中性粒细胞（未经处理或用50μM NE抑制剂ONO-5046处理）放置在带有IL-8（10−7M） 在井底。在37°C下孵育1.5小时后，对过滤器进行层粘连蛋白-1（红色）免疫染色，并用核染料SytoxGreen（绿色）对白细胞进行染色。结果代表了三个独立的实验。棒材，10μm。
图8。
图8。
迁移的中性粒细胞在其细胞表面携带层粘连蛋白。（A） 对IL-1β刺激的小鼠长肌进行LN-α5链、α-SMA（周细胞标记）和MRP-14（中性粒细胞标记）免疫染色，并通过共焦显微镜采集整个血管的三维图像。荧光显微照片显示了同一小静脉段的横截面图像和三维图像，其中迁移的中性粒细胞（箭头）呈LN-α5链阳性。棒材，10μm。（B） 小鼠腹腔注射巯基乙酸，在给予刺激后2小时采集腹膜细胞。通过流式细胞术定量血液或腹腔中性粒细胞上LN-α5和-γ1亚单位的细胞表面表达，结果显示为散射曲线。以粗体显示的每个散射剖面中的数字表示阳性细胞的百分比。刺激后4小时，对细胞样本进行CD41（血小板标记物）染色。结果代表了三个独立的实验。（C） 对IL-1β诱导的腹膜迁移白细胞进行LN-α5链和α6整合素免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。细胞中层切片的代表性图像与其相应的强度剖面一起显示（右）。使用LSM 5 Pascal软件更好地指示LN-α5和α6整合素的彩色化，该软件允许通过叠加在原始RGB图像上的白色遮罩直观地显示两个荧光通道的彩色像素。（D） RT-PCR分析从纯化中性粒细胞（1、3、5道）和从巯基乙酸（1-4道）或IL-1β（5-6道）获得的残余单核细胞（2、4、6道）中提取的β-肌动蛋白、LN-α5和α4链引发的腹膜炎研究。使用汇合的小鼠心脏内皮细胞（泳道7）作为阳性对照。
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