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.2006年5月12日;281(19):13612-13619.
doi:10.1074/jbc。M600456200。 Epub 2006年3月15日。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂独立于HIF-α的直接乙酰化抑制低氧诱导因子的反式激活电位

附属公司

组蛋白去乙酰化酶抑制剂独立于HIF-α的直接乙酰化抑制低氧诱导因子的反式激活电位

唐娜·M·法特等。 生物化学杂志. .

摘要

低氧诱导因子(HIF)是调节氧供应、糖代谢和血管生成的异二聚体转录因子。HIF功能需要通过HIF-α(HIF-alphaCAD)的C末端反式激活域招募p300/CREB-结合蛋白,这是两个具有组蛋白乙酰转移酶活性的辅激活子。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAIs)诱导分化或凋亡,抑制肿瘤生长和血管生成,因此被广泛用作抗癌药物。通过结合药理学、生物化学和遗传学方法,我们发现HDAIs抑制HIF-alphaCAD的反式激活潜能。这种抑制独立于肿瘤抑制因子von Hippel-Lindau或p53的功能或HIF-α的降解。我们还证明了低浓度HDAI在抑制肿瘤细胞中HIF靶基因方面的充分性。我们进一步证明HDAIs在体内诱导p300的超乙酰化并抑制HIF-1alpha.p300复合物。体外乙酰化分析表明,p300CH1区域(而非HIF-alphaCAD)容易乙酰化。综上所述,我们的数据表明,脱乙酰化酶活性对HIF-alphaCAD的反式激活潜能是不可或缺的,并支持一种模型,即乙酰化通过靶向HIF-alfa.p300复合物而非直接乙酰化HIF-alα来调节HIF功能。HDAIs独立于von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子和p53功能抑制HIF-1alpha和HIF-2alpha反式激活潜能的证据表明,HDAIs可能在除肿瘤外的广泛组织中具有生物效应。

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数字

图1
图1。TSA特异性抑制HIF-1αCAD转录激活潜能
A类TSA对启动子作用的标准化表明TSA对其有更大的抑制作用。将pCMV-Gal4-H1α744-826(3μg)、pFR-Luc(2μg)和pRL-CMV(0.1μg)共转染到HeLa细胞中,这些细胞汇集并均匀分布在12孔培养板的孔中。在收获前不久,用不断增加的TSA浓度处理细胞,并用21%或1%的O进行培养2持续12小时。萤火虫荧光素酶活性(佛罗里达州)标准化为雷尼利亚荧光素酶(RL公司)共转染pRL-CMV的活性。在21%(未显示)或1%O中观察到类似的抑制2(此处显示)。B类将共转染pCMV-Gal4-H1α744-826(5μg)和pRL-CMV(0.1μg)的混合HeLa细胞均匀接种在四个培养皿中,并在1%氧气编程的缺氧工作站中培养2.在收获前,立即用Me处理细胞2SO或增加TSA剂量并与1%O孵育2再溶化细胞12小时,每种细胞的一小份用于测定雷尼利亚荧光素酶活性。来自Me的总蛋白质(100μg)2SO处理的细胞(0 nM TSA)用作标准。对于TSA处理的样品,加载含有与标准物相当的RL活性的裂解物。C类TSA不抑制Gal4 DNA结合域的功能。表达Gal4-VP16(3μg)的质粒与pFR-Luc(2μg)和pRL-CMV(0.1μg)共同转染到HeLa细胞中。在双荧光素酶分析之前,将细胞合并,重新接种到多孔培养板中,并立即用指示浓度的TSA处理12小时。所示RLU代表针对RL校正的萤火虫荧光素酶活性。D类,TSA刺激MyoD转录激活活性。将表达pcDNA3-MyoD(3μg)、pRL-CMV(0.1μg)和MyoD反应性氯霉素乙酰转移酶报告基因(2μg)的质粒共转染到HeLa细胞中。用不同剂量的TSA处理转染的细胞12小时。用雷尼利亚荧光素酶活性和氯霉素乙酰转移酶活性测定。E类TSA刺激p53反式激活活性。携带由p21启动子(2μg)控制的萤火虫荧光素酶报告基因的质粒与pcDNA3-p53(3μg)和pRL-CMV(0.1μg)共同转染到HeLa细胞中。在双重荧光素酶分析之前,用增加剂量的TSA处理共转染细胞12小时。
图2
图2。TSA独立于HIF-αNRR抑制HIF-1αCAD和HIF-2αCAD
A类TSA介导的HIF-1αCAD抑制与NRR无关。pcDNA3-Gal4-H1α786-826(3μg)、pFR-Luc(2μg)和pRL-CMV(0.1μg)被联合转染到HeLa细胞中。如上所述进行TSA治疗和荧光素酶分析。B类TSA在无NRR的情况下抑制HIF-2αCAD。在共转染试验中使用表达Gal4-H2αCAD(aa 819–870)的质粒。共转染pRL-CMV(0.1μg)进行标准化。
图3
图3。VHL和p53对HIF-1活性的依赖性抑制
A类B类TSA介导的抑制独立于VHL。如图2所示,在共转染分析中使用VHL缺失的RCC4细胞或具有重建VHL的RCC4-细胞交流D类TSA介导的抑制独立于p53。HCT116携带p53双敲除(C类)和父母HCT116(D类)用于共转染。E类F类,治疗浓度的HDAIs足以抑制HIF-1αCAD的反式激活潜能。与之前一样进行联合转染。转染后24小时,细胞接受增加SAHA浓度的处理(E类)或SBT(F类)在双荧光素酶测定前12小时。
图4
图4。TSA独立于HIF-1α水平抑制内源性HIF活性
A类用pEPO-Luc转染Hep3B细胞,并用增加浓度的TSA处理,在收获前在常氧或缺氧条件下培养8 h。B类,Hep3B细胞用150 n用Western blotting检测TSA对内源性HIF-1α水平的影响。C类在缺乏HIF-α的情况下,TSA不抑制pEPO-Luc报告基因的表达。将pEPO-Luc质粒转染Hep3B细胞。用TSA处理转染的细胞12小时,并测定RLU并将其标准化为总蛋白。D类TSA在没有低氧反应元件(HRE或HIF结合位点)的情况下不抑制EPO启动子。pEb-Luc(4μg)报告子与pEPO-Luc相同,只是缺少HIF结合顺式-元素被转染到Hep3B细胞中,这些细胞用TSA处理并在常氧条件(未显示)或缺氧条件下培养12小时。测定RLU并将其归一化为总蛋白。
图5
图5。TSA对内源性HIF活性的影响
A类低浓度TSA对B1细胞缺氧诱导的HIF-1α水平无影响。用不同浓度的TSA处理B1细胞,并在常氧或缺氧条件下培养8 h。用Western blot检测内源性HIF-1α水平。微管蛋白被检测为负荷指标。B类B1细胞内源性HIF-1α活性的降解依赖性抑制。用不足以诱导HIF-1α降解的TSA浓度处理B1细胞,并在正常或缺氧条件下培养8 h,然后进行荧光素酶分析。C类TSA(600 n)对HeLa细胞中HIF-1α水平没有影响。HeLa细胞在收获前在指定条件下与TSA或不与TSA培养8小时。用Western blot分析总细胞裂解物以测定HIF-1α水平。DFO公司, 130 μ去甲肾上腺素。D类TSA抑制HeLa细胞中的HIF-1靶基因。HeLa细胞在常压或低氧条件下培养(1%O2)提取RNA前,暴露于300 nM TSA中8小时。采用RT-PCR检测HIF靶基因血管内皮生长因子CA-9和谷氨酸1的mRNA水平。检测β-actin和HIF-1αmRNA水平作为对照。处于控制中车道1,RNA与车道4,但省略了逆转录酶。
图6
图6。TSA降低HIF-1α与p300的相关性
A类,HeLa细胞用任一Me处理2SO(−)或TSA(+)(300 n)培养3h,在常压或缺氧条件下培养。细胞裂解物(WCL公司)制备并直接用于Western blot(工作分解结构)(20%)检测HIF-1α、p300和乙酰化组蛋白H的水平或用于免疫沉淀(IP(IP))用抗p300单克隆抗体,然后用蛋白质印迹检测沉淀的p300和共免疫沉淀的HIF-1α。重复使用相同的膜,用抗赖氨酸抗体检测乙酰化蛋白的水平。B类TSA不影响FIH水平。HeLa细胞在指定条件下培养并用Me处理2收获前8小时,SO或500 nM TSA。通过Western blotting检测FIH水平。C类TSA介导的HIF-1αCAD抑制独立于N803。将表达Gal4-H1α727–826N803A(3μg)、pFR-Luc报告基因(2μg)和pRL-CMV(0.1μg)的质粒共转染到HeLa细胞中。TSA的作用通过荧光素酶测定标准化为雷尼利亚荧光素酶来源于共转染的pRL-CMV。D类E类TSA对HIF-1α的核转位无影响。HeLa细胞在常氧或缺氧条件下培养于培养皿中,并用或不用TSA(600 n)处理)固定8 h后,用抗HIF-1α(1:100)和异硫氰酸荧光素结合二级抗体对载玻片进行染色,并在荧光显微镜下进行检查。4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI公司)染色显示细胞核的位置和大小(D类). 此外,HeLa细胞在含或不含去铁胺(130μ)并暴露于TSA(600 n)在收获前保持6小时。进行细胞质和细胞核分离,并用Western blot检测样品。分别检测HDAC1和Hsp90作为核提取物和细胞质样品的样品装载对照(E类).
图7
图7。HIF-1αCAD不是p300乙酰化的靶点
A类,表达为GST融合蛋白的HIF-1α和p300片段的结构示意图。B类p300HAT乙酰化p300CH1,而非HIF-1αCAD。在乙酰化分析中使用覆盖p300CH1和HIF-1α反式激活域的片段[14C] 乙酰辅酶A和重组p300HAT。GST和GST-p53分别作为阴性和阳性对照。顶部考马斯蓝染色凝胶显示蛋白质输入。底部,放射自显影图像显示[14C] 乙酰辅酶A。C类TSA处理的细胞裂解物中的p300(WCL公司)对重组HIF-1αCAD的亲和力较低。在细菌中表达的固定化GST-H1α530-826等分样品(因此缺乏翻译后修饰)与经Me处理的HeLa细胞裂解液培养2SO或TSA。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离GST-H1α530-826下拉复合物,并通过Western blotting检测相关p300。D类,HIF-αCAD氨基酸序列的比对显示没有Lys残基。HIF-1αCAD的氨基酸序列在智人(小时),Bos金牛,Bos grunniens公司,小家鼠,美洲大羚羊,褐家鼠、和三尖锥拟矛菌(Spermophilus tride-cemlineatus)其他物种如下。上海,犹太斯帕拉克斯;xl(xl),爪蟾;普通合伙人,Gymnocyprisprzewalskii裸鼠.#,阿斯恩803.
图8
图8。HDAI介导HIF-αCAD·p300复合物抑制的可能模型
去乙酰化酶活性使p300或蛋白因子,即IPF保持在低乙酰化状态。缺氧时,累积的HIF-1α与HIF-1β二聚体化,招募p300,并与HIF靶基因的HRE结合。HDAIs抑制相关的脱乙酰酶,但HIF-1αCAD(如图所示)不是乙酰化的直接靶点。相反,p300或IPF在HDAIs的存在下会发生高乙酰化。在模型I中,提出p300 CH1结构域的超乙酰化直接干扰相互作用。模型II预测IPF的乙酰化促进其与p300的相互作用。p300和IPF的乙酰化也可能有助于增加p300与IPF之间的相互作用(模型III)。在最后一个模型中,乙酰化IPF可能直接与HIF-αCAD相互作用,从而抑制其转录激活潜能。人力资源,低氧反应元件(HIF结合位点)。

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