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.2006年1月；116(1):125-36.
doi:10.11172/JCI26040。 Epub 2005年12月22日。

转录共抑制剂RIP140对小鼠脂肪细胞氧化代谢和线粒体生物生成的抑制作用

Aimee M Powelka女士 1, 阿莎·塞思, 约瑟夫·维巴修斯, 埃文格洛斯·基斯基尼斯, 萨拉·M·尼科洛罗, 阿德尔森·吉尔赫默, 小清堂, 朱尔格·斯特劳巴尔, 安德鲁·德·切尔尼亚克, 马尔科姆·G·帕克, Michael P捷克语
附属机构

转录共抑制剂RIP140对小鼠脂肪细胞氧化代谢和线粒体生物生成的抑制作用

Aimee M Powelka女士等。 临床研究杂志. 2006年1月.

摘要

通过基于siRNA的筛选，我们确定转录共抑制因子RIP140是3T3-L1脂肪细胞中胰岛素反应性己糖摄取和氧化代谢的负调控因子。Affymetrix基因芯片分析显示，RIP140缺失上调了这些细胞中葡萄糖摄取、糖酵解、TCA循环、脂肪酸氧化、线粒体生物生成和氧化磷酸化途径中基因簇的表达。相反，我们发现RIP140在来自RIP140-null小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞中的再表达下调了许多相同基因的表达。与这些微阵列数据一致，培养脂肪细胞中RIP140基因沉默增加了[14C]葡萄糖转化为CO2和线粒体耗氧量。先前有报道称，RIP140-null小鼠在高脂肪饮食中能够抵抗体重增加，与匹配的野生型小鼠相比，它们在高脂肪喂养中表现出更强的葡萄糖耐量和对胰岛素的反应性。从机械角度来看，RIP140需要核受体ERRapha来调节己糖摄取和线粒体蛋白SDHB和CoxVb，尽管它也可能通过其他核受体发挥作用。我们得出结论，RIP140是脂肪细胞氧化代谢和线粒体生物生成的主要抑制因子，也是小鼠全身糖耐量和能量消耗的负调节因子。

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数字

图1
图1。siRNA-介导的筛选确定Nrip1（RIP140）是3T3-L1脂肪细胞中脱氧葡萄糖摄取的负调节因子。
(A类)诱导分化四天后，用智能siRNA池转染3T3-L1脂肪细胞，以对抗一组基因（GenBank登录号见补充表1），与3T3-LI成纤维细胞相比，这些基因在肌肉和3T3-Ll脂肪细胞中高度表达。使用2-脱氧葡萄糖摄取试验测定每个敲除对葡萄糖摄取的影响。箭头表示RIP140敲除细胞中胰岛素刺激的2-脱氧葡萄糖摄取。所示为2个独立实验的平均值。(B类)实时RT-PCR证实了siRNA介导的RIP140 mRNA缺失。该图表示3个独立实验的平均值±SEM。Scr，加扰；Q-RT-PCR，定量RT-PCR*P（P）与加扰相比<0.05。
图2
图2。RIP140缺失增强了第4天和第8天3T3-L1脂肪细胞中GLUT4的表达和己糖的摄取。
诱导分化后4天或8天，用打乱或RIP140 siRNA转染3T3-L1脂肪细胞。3天后，用细胞裂解物进行SDS-PAGE，以评估GLUT4、GLUT1和肌动蛋白的表达水平。使用完整的细胞检测RIP140缺失对2-脱氧葡萄糖摄取的影响。该图显示了5个独立实验的平均值±SEM*P（P）与学生的打乱相比<0.05t吨测试。
图3
图3。RIP140沉默对胰岛素信号没有显著影响。
诱导分化4天后，用打乱或RIP140 siRNA转染3T3-L1脂肪细胞。3天后，细胞饥饿2小时，然后用胰岛素刺激30分钟。细胞裂解物用于总的和磷酸化的Akt和MAPK印迹。代表性印迹显示，磷酸-胺Akt水平略有增加，但不显著。
图4
图4。RIP140沉默增强3T3-L1脂肪细胞中的多种代谢途径。
诱导分化8天后，用打乱或RIP140 siRNA转染3T3-L1脂肪细胞。3天后，获取mRNA并用于Affymetrix基因芯片分析。显著的基因数量(P（P）<0.05）所示每条通路中表达的增加、减少或不变，在每条通路附近的条形图中进行了描述。显著的总数(P（P）<0.05）右上面板显示了3个独立实验中更换的探针组。脂肪酸转运蛋白；TG、甘油三酯。
图5
图5。RIPKO-1脂肪细胞中RIP140的再表达导致多种代谢途径的下调。
诱导分化10天后，使用慢病毒载体从RIPKO-1脂肪细胞和稳定表达RIP140的RIPKO-1脂肪细胞中分离出RNA，并用于Affymetrix基因芯片分析。所示代谢途径中显著(P（P）<0.05）图中从左到右显示上调、下调或不变。
图6
图6。RIP140缺失的3T3-L1脂肪细胞中代谢和线粒体蛋白表达增强。
诱导分化8天后，用打乱或RIP140 siRNA转染3T3-L1脂肪细胞。72小时后，用核后上清液对氧化磷酸化和脂肪酸氧化途径中的选定蛋白质进行免疫印迹。所示为3个独立实验（平均值±SEM）的代表性印迹和密度定量。所有显示的变化（肌动蛋白除外）在P（P）<0.05（以星号表示）。
图7
图7。RIP140缺失会促进糖酵解和TCA循环，但不会促进甘油三酯合成或从头合成游离脂肪酸。
诱导分化8天后，用打乱的或RIP140 siRNA转染3T3-L1脂肪细胞。72小时后，细胞饥饿，通过[6-14C] -葡萄糖转化为二氧化碳（CO2)方法中所述的甘油三酯和脂肪酸。图表显示了3-4个独立实验的平均值±SEM*P（P）<0.05，与扰乱相比，按学生的t吨测试。
图8
图8。RIP140是3T3-L1脂肪细胞细胞呼吸的负调节因子。
诱导分化8天后，用扰乱的或RIP140 siRNA转染3T3-L1脂肪细胞(A类)72小时后，用MitoTracker Red培养细胞，对活跃的呼吸线粒体进行染色。按照方法进行荧光显微镜检查。所示为具有相同曝光时间的代表性照片。(B类)使用方法中描述的氧生物传感器荧光分析法对细胞进行呼吸测定。左侧显示了基础呼吸，右侧显示了由添加线粒体解偶联剂羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP；33μM）诱导的解偶联呼吸。图示为3-4个独立实验的平均值。根据每次实验中领先曲线的荧光强度等于半最大值时的荧光强度，认为转染了打乱或RIP140 siRNA的细胞在有或无FCCP的情况下的呼吸具有统计差异。RFU，原始荧光单位。
图9
图9。不含RIP140可以防止年龄和饮食诱导的葡萄糖不耐受，并提高高脂肪饮食的胰岛素反应性。
对喂食正常饮食的3个月大雌性小鼠进行葡萄糖耐量试验(A类)，8个月大的雌性小鼠喂食正常的食物(B类)或喂食高脂肪饮食的3个月大雌性小鼠(C类)持续10周。数值为平均值±SEM；n个= 6–12. (D类)对喂食高脂肪饮食9周的3个月龄雌性小鼠进行胰岛素耐受性试验。数值为平均值±SEM；n个= 9.
图10
图10。RIP140缺失不需要正常的PPARγ水平来增强GLUT4的表达。
诱导分化8天后，用打乱的、RIP140、PPARγ或RIP140加PPARγsiRNA转染细胞。3天后，用细胞裂解物免疫印迹GLUT4和肌动蛋白，同时用核提取物免疫印迹PPARγ和层粘连蛋白。使用指示的敲除物进行2-脱氧葡萄糖摄取分析。该图显示了5个独立实验的平均值和SE*P（P）与Student的加扰siRNA相比<0.05t吨测试。
图11
图11。RIP140缺失需要ERRα来增强GLUT4表达、脱氧葡萄糖摄取和线粒体蛋白表达。
诱导分化后8天，细胞转染加扰型、RIP140、ERRα或RIP140加ERRαsiRNA(A类)三天后，用细胞裂解物进行GLUT4、SDHB和肌动蛋白的免疫印迹。显示了具有代表性的印迹和4-5个独立实验的平均值±SEM。(B类)用指示的敲除进行2-脱氧葡萄糖摄取测定。显示了3个独立实验的代表性印迹和平均值±SEM*P（P）与Student的加扰siRNA相比<0.05t吨测试。
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