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.2005年9月;16(9):3919-36.
doi:10.1091/mbc.e04-12-1089。 Epub 2005年6月15日。

肌动蛋白解聚通过小窝介导的内吞破坏紧密连接

附属公司

肌动蛋白解聚通过小窝介导的内吞破坏紧密连接

乐深等。 分子生物学细胞. 2005年9月.

摘要

紧密连接(TJ)决定上皮屏障功能。肌动蛋白解聚破坏TJ结构和屏障功能,但这种作用的机制尚不清楚。本研究的目的是确定这些机制。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞表达增强的绿色荧光蛋白-、增强的黄色荧光蛋白-或单体红色荧光蛋白1-β-actin、clodin、claudin-1、ZO-1、crathrin轻链A1的融合蛋白,利用时间推移多维荧光显微镜对caveolin-1和caveolin进行成像,同时测量跨上皮电阻(TER)。用latrunculin A(LatA)诱导肌动蛋白解聚。拉塔加法后几分钟内,TER开始下降。这与闭塞素的再分配和内化相一致。相反,ZO-1和claudin-1在TER最大损失后很好地重新分布。在14℃时,阻断蛋白内化和TER丢失,而不是肌动蛋白解聚被阻断,这表明这两个事件都需要膜交通。用0.4M蔗糖抑制膜交通也阻止了闭塞素内化和TER丢失。内化闭塞素与小窝蛋白-1和动态蛋白II共定位,但不与氯菊酯共定位,内化被显性阴性动态蛋白II(K44A)阻断,但不被Eps15Delta95-295表达阻断。胆固醇提取抑制小窝介导的内吞作用可防止LatA诱导的TER丢失和闭塞素内化。因此,LatA诱导的肌动蛋白解聚通过包括小窝介导的TJ成分内吞在内的机制导致TJ结构和功能的破坏。

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数字

图1。
图1。
LatA导致功能和结构TJ中断。(A) 用指定浓度的LatA或细胞松弛素D(cytoD)处理MDCK单层。药物添加后30分钟显示TER。低剂量细胞松弛素D增加TER,而高剂量降低TER。LatA仅引起剂量依赖性TER丢失。(B) TER损失与添加LatA后的F-actin损失相似。单层用0.5μM LatA处理指定时间。(C–G)LatA导致F-actin和TJ蛋白的渐进性破坏。单层用0.5μM LatA处理指定时间,固定,并用阴茎倍体蛋白染色以检测F-actin(C和D)。显示了TJ(C)和基底应力纤维(D)水平的图像。20分钟时,心尖肌动蛋白逐渐丢失,结合部肌动蛋白环(箭头)部分断裂。加入LatA 20分钟后,基底应力纤维密度也开始下降。LatA治疗导致闭塞素(E)、ZO-1(F)和克劳丁-4(G)的TJ分布出现不连续性(箭头),20分钟后首次检测到。Bar,10μm。
图2。
图2。
荧光标记紧密连接蛋白在MDCK单层中的表达。用免疫印迹法研究表达mRFP1-occludin(A)、mRFP-ZO-1(B)和EGFP-claudin-1(C)的非转染(MDCK)和稳定转染(转染)MDCK细胞的(A-C)裂解物。融合蛋白的表达小于或等于每个蛋白的内源性表达。(D–F)固定稳定转染的MDCK细胞单层,表达mRFP1-occludin(D)、mRFP-ZO-1(E)和EGFP-claudin-1(F),并对相应的内源性蛋白进行免疫染色。在所有情况下,融合蛋白(左)与内源性蛋白(中)共定位。在等密度蔗糖梯度上分离非转染(MDCK)和稳定转染(转染)单层表达mRFP1-occludin(G)或EGFP-claudin-1(H)的(G和H)裂解产物。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析组分。在稳定转染体中以及与未转染细胞相比,融合蛋白与内源性蛋白存在相同的组分。
图3。
图3。
LatA治疗期间的活细胞成像可以识别与TER丢失相关的形态学事件。(A) 实验仪器。在直径为24 mm的Transwell上生长的MDCK单层在温度控制阶段(除非另有说明,否则设置为37°C)安装在改良的35 mm直径培养皿上。水浸物镜从顶端介质中拍摄单层。单分子膜两侧的Ag-AgCl电极连接到EVOM以测量TER。(B) 稳定表达EGFP-β-肌动蛋白(左)和mRFP1-糖蛋白(中)的汇合单层以1分钟间隔成像,持续30分钟。与MDCK中表达的转基因的典型情况一样,融合蛋白的表达,即荧光强度,在细胞间存在差异。图中显示了TJ水平的单个z平面。在此期间,EGFP-β-actin和mRFP1-occludin的TER和定位均稳定。棒材,20μm。(C) 在添加0.5μM LatA后,以1分钟间隔40分钟,将稳定表达EGFP-β-actin(左)和mRFP1-occludin(中)的汇合单层成像为z堆叠。图中显示了位于TJ水平面的单个z平面。每帧中显示LatA加法后的时间和TER,在LatA加法前将其归一化为TER。开放箭头显示肌动蛋白在顶端表面的聚集和融合。实心箭头显示了mRFP1-occludin荧光强度沿TJ的变化以及含有mRFP1-ocludin的小泡的形成。棒材,20μm。(D) 在添加0.5μM LatA后,将稳定表达mRFP1-occludin(如图所示)和EGFP-β-actin(未示)的汇合单层以1分钟间隔40分钟的z堆叠成像。图中显示了TJ水平的单个z平面。LatA添加后的时间显示在每个帧中。箭头显示添加LatA后2分钟开始从TJ发出多个囊泡。棒,10μm。(E) 将稳定表达mRFP1-occludin(显示)和EGFP-β-actin(未显示)的融合单层冷却至14°C,用0.5μM LatA处理30 min,并加热至37°C。然后以10-s的间隔将它们成像为有限的z堆栈。图中显示了TJ水平的单个z平面。箭头显示了闭塞素浓缩、出芽和脱离形成单个囊泡的过程。棒材,2μm。(F) 将单层膜作为E处理,以同步囊泡萌发。在升温至37°C后10分钟,用-20°C甲醇/BS固定单层3对闭塞素进行染色,收集z堆叠。显示了控制和LatA处理单层的代表性xz重建。LatA治疗导致TJ下部附近出现出芽和分离的闭塞阳性结构,即靠近TJ边界和侧膜。
图4。
图4。
LatA诱导的TER丢失与ZO-1、claudin-1或E-cadherin的重新分布无关。(A)在添加0.5μM LatA后,稳定表达EGFP-β-actin(左)和mRFP1-ZO-1(中)的合流单层以1分钟间隔成像为z堆叠,持续40分钟。图中显示了TJ水平的单个z平面。每帧中显示LatA加法后的时间和TER,在LatA加法前将其归一化为TER。开放箭头显示顶端表面富含肌动蛋白区域的聚集和融合。实心箭头显示mRFP1-ZO-1荧光强度沿TJ.Bar(20μm)的变化。(B) 在添加0.5μM LatA后,以1分钟间隔40分钟,将稳定表达EGFP-claudin-1(左)和mRFP1-occludin(中)的融合单层成像为z堆叠。图中显示了TJ水平的单个z平面。LatA相加后的时间和TER,归一化为LatA相加前的TER,显示在每一帧中。打开的箭头显示添加LatA后EGFP-claudin-1荧光强度沿TJ的变化。直到添加LatA后12分钟,TER已经下降62%,这些才明显。实心箭头显示了mRFP1-occludin荧光强度沿TJ的变化以及含有mRFP1-ocludin的小泡的形成。棒材,20μm。(C) 未经处理(顶部)或用0.5μM LatA(底部)处理20分钟的MDCK单层用-20°C甲醇/BS固定3并对闭塞素(左)和E-cadherin(中)进行染色。尽管LatA治疗扰乱了闭塞素的分布,但E-cadherin的分布没有被破坏(合并图像)。这在较高放大倍数下得到了证实(最右侧)。棒材,5μm。
图5。
图5。
LatA诱导的TER丢失和闭塞素再分布需要膜交通。(A) 在添加0.5μM LatA之前,在指示温度下培养MDCK单层30分钟。由于降低的温度升高了TER,因此添加LatA后30分钟的值将归一化为添加LatB前的值。(B) 添加0.5μM LatA后,在14℃孵育的表达EGFP-β-actin(左)和mRFP1-occludin(中)的MDCK单层以1分钟间隔40分钟的z堆叠成像。图中显示了TJ水平的单个z平面。LatA添加后的时间显示在每一帧中。与37°C相比,LatA在14°C时未诱导闭塞素内化。然而,肌动蛋白从TJ中丢失。这在合并图像中可以得到最好的理解,因为EGFP-β-actin的丢失,TJ从黄色变为红色。Bar,20μm。(C) 在添加LatA之前,在HBSS中用0.4 M蔗糖培养单层细胞1小时。添加LatA后30分钟显示TER。在含0.4M蔗糖的HBSS中培养,TER降低至对照的36±2.3%,但添加LatA不会导致进一步的TER损失。(D) 将MDCK单层在37℃HBSS、14℃HBSS或37℃HBSS中与0.4 M蔗糖平衡1 h,然后在相同条件下不使用或使用0.5μM LatA处理30 min。用-20°C甲醇/BS固定单层3并用小鼠抗闭塞素抗体染色。经LatA治疗后,TJ处的闭塞素被破坏,含闭塞素的小泡数量增加。与活细胞成像(B)一样,在14°C下培养可防止闭塞小泡的积聚。在含0.4M蔗糖的HBSS中培养也可防止闭塞性小泡的积聚。棒材,10μm。(E) 闭塞素内化的形态计量学分析。每个数据集显示了20个代表性细胞的每个细胞的闭塞素小泡的个体数量以及每个细胞闭塞素小囊的平均数量。
图6。
图6。
闭塞素通过dynamin-II依赖性途径内化。(A) 未经处理(顶部)或用0.5μM LatA(底部)处理30分钟的MDCK单层用-20°C甲醇/BS固定3并对occludin(左)和dynamicin II(中)进行染色。经LatA治疗后,共定位明显增加(合并图像,箭头)。棒材,10μm。高倍镜下更容易看到结肠化(最右边)。棒材,5μm。(B) 闭塞素和动力蛋白II共定位的形态计量学分析。每个数据集显示了20个代表性细胞的每个细胞中标记为闭塞素和动力蛋白II的小泡的单个数量,以及每个细胞中此类小泡的平均数量。包含dynamin II的闭塞素囊泡的百分比显示在每个数据集的下面。(C) 用dynamin II-EGFP瞬时转染MDCK单层,并在不含或含0.5μM LatA的情况下培养30分钟,然后用-20°C甲醇/BS固定3对单层occludin(左)和EGFP(右)进行染色。转染细胞(开放箭头)通过EGFP的存在进行鉴定。表达dynamin II-EGFP的细胞在LatA处理后与未转染细胞一样内化闭塞素。箭头显示LatA处理后,dynamin II-EGFP转染细胞中含有闭塞素的小泡积聚。棒材,10μm。(D) 闭塞素内化的形态计量学分析。每个数据集显示了20个代表性细胞的每个细胞的闭塞素小泡的个体数量以及每个细胞闭塞素小囊的平均数量。(E) 用dynamin II K44A-EGFP瞬时转染MDCK单分子膜,并在不含或含0.5μM LatA的培养基中培养30分钟,然后用-20°C甲醇/BS固定3单层染色检测闭塞素(左)和EGFP(右)。通过EGFP的存在来鉴定转染的细胞(开放箭头)。表达dynamin II K44A-EGFP的细胞在LatA治疗前可增加闭塞素小泡的数量,但在LatB治疗后不会进一步增加该数量。这些条件的形态分析以10μm的D.Bar表示。
图7。
图7。
在LatA-诱导的内化过程中,闭塞素与小窝蛋白-1共定位,但不与氯菊酯轻链A1共定位。(A) 在LatA治疗后,对表达mRFP1-occludin和EYFP-clathrin轻链A1的MDCK单层进行成像。这些图像以30秒的间隔显示mRFP1-occludin的内化(箭头),但EYFP-clathrin轻链A1分布没有变化。棒材,2μm。(B) 在LatA治疗后,对表达mRFP1-occludin和caveolin-1-EGFP的MDCK单层进行成像。这些图像以15秒的间隔显示了mRFP1-occludin和caveolin-1-EGFP的共同国际化(箭头)。棒材,2μm。(C) 在LatA治疗后,对表达mRFP1-occludin和caveolin-1-EGFP的MDCK单层进行成像。这些图像每隔15秒出现一次,之前10–15分钟内化一个小泡(箭头所示)。mRFP1-occludin和caveolin-1-EGFP最初在囊泡内共定位。然后,一些mRFP1-occludin从caveolin-1-EGFP中分离出来(箭头),首先是在似乎是单个囊泡的囊泡中,然后是在不包含caveolin-1-EGFP.的单独囊泡(箭头)中。棒材,2μm。
图8。
图8。
在LatA诱导内化后,闭塞素主要与小窝蛋白-1共定位,但不与氯菊酯、EEA1或LAMP-1共定位。(A) 将MDCK单层冷却至14°C,用0.5μM LatA处理30分钟,并在用–20°C甲醇/BS固定之前加热至37°C指定时间3并对闭塞素(左)和小窝蛋白-1(中)进行染色。升温后,同位化明显增加,10分钟后最为明显(合并图像、箭头)。高倍镜下(最右侧)证实了这种共定位。棒材:5μm。(B) 将MDCK单层冷却至14°C,用0.5μM LatA处理30 min,并加热至37°C指定时间,然后用-20°C甲醇/BS固定3闭塞素(左)和氯氰菊酯重链(中)染色。加热前后没有明显的共定位(合并图像)。这种缺乏共定位的现象在高倍镜下得到证实(最右侧)。棒材,5μm。(C) 将MDCK单层冷却至14°C,用0.5μM LatA处理30 min,并加热至37°C指定时间,然后用-20°C甲醇/BS固定3并对闭塞素(左)和EEA1(中)进行染色。升温前或升温后10分钟没有明显的共定位,但升温后20分钟出现有限的共定位(合并图像、箭头)。高倍镜下证实结肠化(最右侧)。棒材,5μm。(D) 将MDCK单层冷却至14°C,用0.5μM LatA处理30 min,并加热至37°C指定时间,然后用-20°C甲醇/BS固定3并对闭塞素(左)和LAMP-1(中)进行染色。升温前或升温后10分钟没有明显的共定位,但升温后20分钟出现有限的共定位(合并图像、箭头)。在更高的放大倍数下(最右边)确认了共定位。棒材,5μm。
图9。
图9。
在LatA诱导的内化后,Occludin通过含有小窝蛋白-1的隔间。加温后0、10和20分钟,闭塞素与小窝蛋白-1、氯氰菊酯重链、EEA1和LAMP-1共定位的形态计量学分析。每个数据集都显示了在每种情况下标记闭塞素和另一种指示抗原的20个代表性细胞的囊泡部分。
图10。
图10。
LatA诱导的屏障功能障碍或闭塞素内化既不需要大胞饮作用,也不需要网格蛋白介导的内吞作用。(A) 用阿米洛利或LY294002预处理的单层用0.5μM LatA处理。添加LatA后30分钟显示TER。大胞饮抑制剂均未阻止添加LatA后TER的丢失。(B) 与未经氯丙嗪处理的对照单层相比,用氯丙嗪治疗的单层显示出明显的TER增加。然而,氯丙嗪抑制氯氰菊酯介导的内吞作用,不能阻止添加LatA后TER的丢失。(C) 用EGFP-EpsΔ95-295瞬时转染MDCK单层,用-20°C甲醇/BS固定后,在不含或含0.5μM LatA的条件下培养30分钟3单层染色检测闭塞素(左)和EGFP(右)。通过EGFP的存在鉴定转基因细胞。表达EGFP-EpsΔ95-295的细胞在LatA治疗后以与未转染细胞无法区分的方式内化了闭塞素,如图4D。棒,5μm。
图11。
图11。
LatA诱导的屏障功能障碍和闭塞素内化需要Caveolae介导的内吞作用。(A) 与未经MBCD或fillipin III治疗的对照单层相比,用MBCD或philipin III处理单层可使TER适度降低。然而,添加LatA后,TER没有进一步降低。(B) 用MBCD预处理MDCK单层,然后用额外的MBCD或MBCD-胆固醇复合物(MBCD+胆固醇)处理,然后用0.5μM LatA处理30分钟。如上所述,MBCD阻止了LatA诱导的TER丢失,但通过胆固醇补充恢复了对LatA的敏感性。(C) 用MBCD预处理MDCK单层,然后用额外的MBCD或MBCD-胆固醇复合物(MBCD+胆固醇)处理,然后用0.5μM LatA处理30分钟,用-20°C甲醇/BS固定后3对单层进行occludin染色。与对TER的影响一致,MBCD阻止了LatA诱导的闭塞素内化,但通过胆固醇补充恢复了对LatA的敏感性。棒材,5μm。(D) MBCD-治疗单层膜中闭塞素内化的形态计量学分析。每个数据集显示了20个代表性细胞的每个细胞的闭塞素小泡的个体数量以及每个细胞闭塞素小囊的平均数量。MBCD阻止了LatA诱导的闭塞性囊泡增加。

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引用人

工具书类

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