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.2005年1月3日；168(1):141-53.
doi:10.1083/jcb.200405094。

CLASP1和CLASP2与EB1结合并调节细胞皮层的微管脉冲增强动力学

三森由子（Yuko Mimori-Kiyosue） 1, 伊利亚·格里戈里耶夫, 吉迪恩·兰斯伯格, 佐佐木裕久, 松井章男（Chiyuki Matsui）, 费多·塞韦林, 尼尔斯·加尔贾特, 弗兰克·格罗斯维尔, 伊万·沃罗布耶夫, 津田昭一郎, 安娜·阿赫曼诺娃
附属公司

CLAP1和CLAP2与EB1结合并调节细胞皮层的微管加末端动力学

三森由子（Yuko Mimori-Kiyosue）等。 J细胞生物学. .

摘要

CLIP-associating protein（CLASP）1和CLASP2是哺乳动物微管（MT）plus-end结合蛋白，与CLIP-170和CLIP-115相关。通过对HeLa细胞进行RNA干扰，我们发现这两个CLASP在调节间期MT的密度、长度分布和稳定性方面发挥着冗余作用。CLASP通过促进暂停、限制MT生长和缩短外周细胞区域的发作来稳定MT。我们证明CLASPs的中间部分直接与EB1和MT结合。此外，我们还证明CLASP2与细胞皮层的结合是MT独立的，并且依赖于其COOH末端结构域。CLASP的EB1和皮质结合域都需要促进MT的稳定性。我们认为，CLASP可能通过在MT末端与EB1形成复合物，介导MT+末端与细胞皮层之间的相互作用，并作为局部救援因子。

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数字

图1。
图1。
CLASP特异性抗体和RNAi工具的特征。（A） 转染GFP-CLASP1α（第1道）、GFP-CLASP2α（第2道）或模拟转染（第3道）的HeLa细胞的裂解物用所示抗体进行Western blotting分析。（B） 在转染后24、48或72小时制备转染有所示siRNA的HeLa细胞裂解液，并用所示抗体进行Western印迹分析。转染后72 h制备转染有指示siRNA的HeLa细胞（C和D）裂解物，并用指示抗体进行Western印迹分析。（E） 转染对照siRNA、CLASP1+2#A或#B siRNA的HeLa细胞，转染72 h后用#402或#2358抗体混合物染色，并用FACS分析。（F） 用抗体#402（CLASP1）和#2358（CLASP2）以及α-微管蛋白或高尔基标记物GM130的混合物对HeLa细胞进行染色。棒材，10μm。（G） 转染对照siRNA或CLASP1+2#B siRNA的HeLa细胞在转染72 h后用#402或#2358抗体染色。棒材，10μm。
图2。
图2。
CLASP击倒对相间MT网络的影响。（A和B）HeLa细胞转染对照siRNA（A）或CLASP1+2#B siRNA（B）72小时后，用甲醇固定，并染色α-微管蛋白。棒材，10μm。（C） 转染指定的siRNAs 72 h后，HeLa细胞中α-微管蛋白染色的积分荧光强度图，如A和B中所示。积分强度在5μm范围内测量2盒子距离细胞边缘5μm，减去背景。在三个不同的细胞区域中，每siRNA约30个细胞进行测量。与对照组显著不同的数值（P<0.001）用星号表示。（D） 用对照siRNA转染72小时后，HeLa细胞中细胞扇区梯形部分（带基底b和侧面h）的MT末端数量（30个细胞，n个=587）或CLASP1+2#B siRNA（30个细胞，n个= 401). （E） 5μm内的积分强度2在与D所述相同的细胞中沿细胞半径测量盒。MTOC，即MT组织中心，被确定为MTs的径向聚集点。（F）HeLa细胞，用对照siRNA或CLASP1+2#B siRNA转染，甲醇固定，并对CLASP进行染色（与#402或#2358抗体混合使用）微管蛋白转染72h。选择具有代表性的细胞，包括高水平和低水平CLASP染色的示例。绘制CLASP染色积分强度与微管蛋白染色积分强度的关系图。每个点代表一个单元格外围不同区域中五个独立测量值的平均值。回归线以红色显示，95%置信区间以灰色线表示。（G） D所示细胞扇形区梯形部分内MT末端到细胞边缘的距离分布。分析图像与D所示相同。（H）MT远端节段与细胞半径的角度分布。分析图像与D.（I）HeLa细胞的共聚焦显微镜图像（1-μm光学切片）相同，用对照或CLASP1+2#B siRNAs转染后72小时用甲醛固定，并对α-微管蛋白进行染色。固定前，对照细胞也在4°C下培养1小时，以解聚MT（“冷处理”）。棒材，10μm。（J） 可溶性微管蛋白染色强度比值图IS公司（减去背景后）至聚合物染色强度IP（P）（减去背景和I后S公司)，从H所示的图像中获得。在20个对照细胞中进行测量(n个=158），35个CLASP敲除细胞(n个=225）和18个冷处理细胞(n个= 130). 误差条代表SD。
图3。
图3。
CLASP击倒对MT动力学的影响。（A） 用对照或CLASP1+2#A siRNA转染HeLa细胞72小时后，稳定表达GFP-α-微管蛋白的时间推移图像。为了挽救，在siRNA转染后48小时，用mRFP-CLASP2α转染CLASP1+2#A siRNA处理的细胞，24小时后观察。在“救援”面板中，mRFP-CLASP2α显示为红色，GFP-α-微管蛋白显示为绿色。棒材，5μm。（B） MT的停留时间在距离细胞边缘1μm的范围内结束，根据A所示的延时图像序列确定（以2秒的间隔对细胞进行成像）。对照组和CLASP击倒组之间的差异具有统计学意义（P<0.001），对照组和抢救组之间的差别不显著。（C） 用对照或CLASP1+2#A siRNAs转染后72小时，HeLa细胞稳定表达EB1-GFP的时间推移图像。按照A所述进行救援。在“救援”面板中，mRFP-CLASP2α显示为红色，EB1-GFP显示为绿色。单元格边距由箭头指示。棒材，5μm。（D） 从单元格边缘缩短偏移的长度，从与A和B中相同的数据集测量。误差条表示SD。
图4。
图4。
CLASP1和2中MT plus-end结合域和EB1-结合域的鉴定。将CLASP2α、CLASP2γ、不同CLASP2β缺失突变体、CLASP1α及其缺失突变体的（A–G）GFP融合物转染COS-1或COS-7细胞，固定并复染EB1，MT plus-end累积评估为：++，strong；+，清晰可见；+/-，微弱可检测，−，不可检测。B、 C、F、GFP信号；D、 E、G、EB1染色。棒材，10μm。（H） 将CLASP2-M片段的重复部分与CLASP1和D.黑腹果蝇轨道/桅杆。不同类型的重复由不同的箭头表示。（一） 考马斯染色凝胶，显示纯化的HIS标记的GFP-CLASP2-M和GFP。（J） 使用纯化的GFP-CLASP2-M和GFP进行MT造粒分析。考马斯染色凝胶用于微管蛋白和免疫印迹，以及GFP融合的抗GFP抗体。S、 上清液；P、 颗粒。（K） 用来自COS-1细胞的抗GFP抗体免疫沉淀，转染所示GFP-CLASP1和2个缺失突变体。（五十） 本研究中使用的EB1结构和缺失突变体的示意图。CH，钙调素同源结构域；CC，螺旋线圈；Ac，酸性尾结构域。（M） 用指示的GST融合进行GST下拉分析。使用纯化的GFP-CLASP2-M和GFP或COS-1细胞提取物，过度表达GFP-CLAP1α、GFP-CLASP2和GFP-CLASCP2-ΔM。考马斯染色凝胶显示GST融合和带有GFP融合抗GFP抗体的蛋白印迹。将10%的输入物和25%的材料装填在凝胶上，并与珠子结合。（N） 用来自COS-1细胞的抗GFP抗体免疫沉淀，转染所示GFP-EB1融合。（O） 用兔抗EB1多克隆抗体或来自未转染COS-1细胞的对照兔IgG进行免疫沉淀。
图5。
图5。
CLASP2缺失突变体对CLIP-170的依赖性，其定位于MT提示和EB1招募到MT。（A和B）COS-7细胞转染GFP-CLASP2-ΔM，并进行CLIP-170染色。（C） 示意图表示本研究中使用的CLIP-170的结构和显性负结构。（D–F）COS-7细胞与GFP-CLASP2-ΔM和显性阴性CLIP-170共转染，并用其NH抗体对EB1和内源性CLIP-170EB1进行染色2终点。表达显性阴性CLIP-170结构的细胞可以通过内源性CLIP-170-染色的扩散模式识别。（G–I）COS-7细胞与GFP-CLASP2-M和显性阴性CLIP-170共转染，并对EB1、内源性CLIP-1七十进行染色（使用其NH抗体2末端）和显性阴性CLIP-170（使用针对其COOH末端的抗体）。（J–L）COS-7细胞转染GFP-CLASP2γ（J），并对CLIP-170（K）和EB1（L）进行染色。用GFP-CLASS2-ΔC（M）转染（M–O）COS-7细胞，并对CLIP-170（N）和EB1（O）进行染色。插图中显示了方框区域的放大部分。棒材，10μm。
图6。
图6。
CLASP2的COOH末端结构域负责与细胞皮层和高尔基复合体的联系。（A–F）表达GFP-CLASP1α（A）、GFP-CLASP2γ（B）、GFPα-微管蛋白（C和D）或EB3-GFP（E和F）的活HeLa细胞的TIRF显微镜图像。细胞不是用siRNA（A和B）处理，就是用对照（C和E）或CLASP1+2#B siRNA（D和F）处理72小时。对比度是颠倒的。棒材，10μm。（G） CLASP2γ和相关缺失突变体的示意图。（H） 用GFP-CLASP2-C转染HeLa细胞，并对其进行高尔基体标记物GM130染色。棒材，10μm。（一） 用GFP-CLASP2或GFP-CLASP2-ΔC转染HeLa细胞，固定前直接固定或用10μM诺卡唑处理1h，并染色α-微管蛋白。棒材，10μm。
图7。
图7。
利用CLASP2缺失突变体和CLASP在细胞皮层的作用模型挽救CLASP敲除。（A–F）HeLa细胞，如图3 A所示，去除CLASP，转染不同的拯救结构（如左图所示），用甲醇固定，并染色α-微管蛋白（A–D）或EB1（E和F）。用共焦显微镜（1μm厚光学切片）采集细胞图像。GFP（绿色）和tubulin/EB1（红色）信号叠加在右侧。插图中显示了方框区域的放大部分。棒材，10μm。（G） α-微管蛋白染色的平均像素强度（每个结构约10个细胞）。（H） MT荧光平均像素强度比（I机器翻译)GFP荧光的积分强度（IGFP公司; ∼每个构造10个单元格）。（一） 细胞皮层CLASP救援活动的建议模型。CLASP可以直接和/或通过与EB1的结合与生长MT的正端相互作用，同时与细胞皮层接触。MT发生灾难后，大部分EB1蛋白从末端丢失，但CLASP仍与解聚MT的皮层和外周延伸相关。通过增强这些位点上EB1-MT相互作用的亲和力，CLASP有助于保留和/或招募EB1到这些MT，从而拯救它们。控制细胞中皮层MT尖端的EB1信号振荡支持这一观点（与生长期相对应的强烈EB1积累，以及在暂停/解聚过程中观察到的微弱EB1积累）。误差条代表SD。
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