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比较研究
.2002年6月24日;157(7):1151-60.
doi:10.1083/jcb.200108103。 Epub 2002年6月24日。

细胞应激从内质网传递到线粒体:Lon蛋白酶的增强表达

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比较研究

细胞应激从内质网传递到线粒体:Lon蛋白酶的增强表达

奥萨穆·霍里等。 J细胞生物学. .

摘要

从缺氧培养的星形胶质细胞中克隆出线粒体ATP依赖性蛋白酶Lon的大鼠同源物。在体外缺氧或内质网应激可增强Lon的表达,在体内脑缺血可使Lon表达增强。这些观察结果表明,内质网应激引起的核基因表达(Lon)变化可能影响重要的线粒体过程,如细胞色素c氧化酶(COX)的组装和/或降解。事实上,在内质网应激下,核编码的COX IV和V的稳态水平降低,线粒体编码的亚单位II迅速降解。用环己酰亚胺处理细胞会导致COX亚单位积累的类似失衡,并增强Lon和Yme1的mRNA,后者是另一种线粒体ATP依赖性蛋白酶。此外,内质网应激对PERK(-/-)细胞Lon或GRP75/mtHSP70的诱导受到抑制。转染研究表明,野生型或蛋白水解不活跃的Lon的过度表达促进COX II组装成含COX I的复合物,并部分防止了由brefeldin a或缺氧引起的线粒体功能障碍。这些观察结果表明,内质网应激对蛋白质合成的抑制对线粒体相关蛋白的合成有复杂的影响,COX亚单位和ATP依赖性蛋白酶和/或有助于COX复合物组装的伴侣。

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图1。
图1。
细胞应激反应中Lon的表达。(A) Lon和GRP78 mRNA在培养的星形胶质细胞中的表达受不同应激时间的影响:N,常压22 h;H16和H22,分别缺氧16和22小时;R、 缺氧22小时,然后再复氧4小时。第三个(深色)面板显示溴化乙锭染色凝胶。Lon mRNA相对强度的量化通过激光密度测定完成,并显示为倍数增加(正常对照组被任意指定值为1)。所示值为三个实验的平均值±SD。(B) 受到其他形式应激的HeLa细胞中Lon、GRP78、GRP75/mtHSP70、HSP60和Yme1 mRNA的表达。Tm(2μg/ml,16小时);BFA(5μg/ml,16小时);Tg(无治疗)。(C) 放线菌素D对Lon和Yme1表达的影响。在有/无衣霉素的情况下,HeLa细胞暴露于放线菌素D(AcD;5μg/ml)达指定时间(细胞用衣霉素预处理16 h),并进行Northern印迹。(D) Lon启动子–荧光素酶结构体的相对荧光素素酶活性。用pRL-SV40将人或小鼠Lon启动子、pGL3基本载体中的野生型或突变型GRP78启动子或pGL3基础载体单独转染HeLa细胞。如文中所述,测量相对荧光素酶活性。(E) 内质网应激反应中Lon蛋白的表达。如上所述,用Tm、BFA或Tg处理HeLa细胞,并用抗Lon抗体665进行Western印迹。同时运行的分子量标准的迁移在最左边以kD表示。(F) 使用如上所述经Tm处理的HeLa细胞的细胞提取物来检测Lon抗原与100倍合成Lon肽的竞争。
图2。
图2。
Lon在缺血大鼠脑中的表达。(A) 对MCA闭塞(8小时;I,缺血)或假手术(8小时;C,对照)后大鼠大脑的总RNA(10μg)进行Northern印迹(顶部)。底部面板显示溴化乙锭染色凝胶。(B) 用Lon cDNA衍生的核糖探针原位杂交研究MCA闭塞(8 h)后的脑切片。棒材,200μm。(C) MCA闭塞后Lon抗原的表达。MCA手术(8 h,I)或假手术(8小时,C)后的脑匀浆(50μg蛋白质)用抗Lon抗体665进行Western blotting。同时运行的分子量标准的迁移在最左边以kD表示。
图3。
图3。
内质网应激对COX亚单位表达的影响。(A) 如图1图例所示,用Tm、BFA、Tg处理HeLa细胞,或单独在培养基(C)中培养16 h。然后用抗COX I、II、IV、V或KDEL抗体进行蛋白质印迹。用碱性磷酸酶偶联的二级抗体鉴定一级抗体结合位点。(B) 用激光密度计定量A中的带强度。显示了ER应力(A,2–4车道)下与控制(A,1车道)相比的频带强度百分比。所示值为三个实验的平均值±SD。(C) Tm治疗引起COX亚单位表达变化的时间进程。按照A.(D)内质网应激下COX亚基的周转进行蛋白质印迹。如文中所述,使用HeLa细胞在存在Tm(用Tm预处理16小时)或仅在培养基中进行脉冲相分析,并使用指示的抗体进行免疫沉淀,然后进行放射自显影。(E) Tm处理(16 h)对COX I和II胰蛋白酶敏感性的影响。如文中所述分离线粒体,蛋白提取物与指示浓度的胰蛋白酶在冰上孵育30分钟。然后进行蛋白质印迹,并通过ECL方法确定一级抗体结合位点。
图4。
图4。
抑制蛋白质合成对COX亚基和Lon表达的影响。(A) 在HeLa细胞暴露于环己酰亚胺4 h(1–3道)或8 h(4–6道)后,按照图3A所述进行蛋白质印迹。(B) 环己酰亚胺存在下COX亚基的周转。将HeLa细胞暴露于环己酰亚胺(用环己酰酮预处理4小时)或仅在培养基中进行脉冲相分析。然后按照图3 D的图例进行免疫沉淀。(C)在环己酰亚胺存在下Lon、Yme1和GRP78的表达。使用暴露于环己酰亚胺(2μg/ml)的HeLa细胞总RNA(10μg)在指定时间内进行Northern印迹。(D) PERK对Lon和GRP75/mtHSP75表达的要求。用Tm或Tg处理细胞指定时间后,用野生型或PERK(−/−)小鼠胚胎成纤维细胞的总RNA进行Northern印迹。底部面板显示作为对照的β-肌动蛋白转录物的数量。
图5。
图5。
Lon的瞬时过表达对COX II的组装和降解的影响。(A) 异位表达的Lon抗原的表达和定位。将每个构建体(野生型、S845N或K519N-Lon)插入pME18Sf+/hyro中,并转染到293T细胞中。48小时后收获培养物,并按文中所述获得粗和亚粗软骨组分。然后用抗FLAG(针对体外表达的Lon)、抗COX II、抗HSP60或抗KDEL抗体进行蛋白质印迹。C、 胞浆;IM,内膜;IMS,膜间空间;M、 微粒体;线粒体;Mtx,矩阵;N、 细胞核;和OM,外膜。(B) 检测内源性和外源性表达的Lon抗原。使用来自模拟、野生型或S845N转染的293T细胞的全细胞裂解物,用抗FLAG抗体进行蛋白质印迹。(C) 如图3 E所示,对COX I和II在衣霉素存在下的胰蛋白酶敏感性进行评估。(D)通过激光密度计对(B)中的带强度进行定量。用胰蛋白酶(250μg/ml)消化后COX II抗原的水平/强度显示为在无胰蛋白酶的情况下与COX II抗体的百分比强度。所示值为三个实验的平均值±SD。(E) 在衣霉素存在下COX II的营业额。用293T细胞在衣霉素存在下过度表达Lon进行脉冲期分析(用Tm预处理16 h),然后用抗COX II抗体进行免疫沉淀。
图6。
图6。
Lon稳定过表达对COX II组装的影响。(A) 稳定转染HeLa细胞表达野生型或S845N-Lon。用抗Lon 665或抗FLAG抗体进行Western blotting。(B) 如图3 E所示,在稳定转染的HeLa细胞中评估了在Tm存在下COX II的胰蛋白酶敏感性。(C)通过激光密度计对(B)中的带强度进行量化。用胰蛋白酶(250μg/ml)消化后COX II抗原的水平/强度显示为在无胰蛋白酶的情况下强度与COX II抗体的百分比。所示值为三个实验的平均值±SD。(D) 通过免疫沉淀法(IP)检测与COX I结合的COX II和总COX II抗原,然后用抗COX II抗体进行免疫印迹(Blot)。(E) COX II与COX I结合的百分比。所示值为三个实验的平均值±SD。
图7。
图7。
Lon过度表达对BFA治疗或缺氧引起的线粒体功能障碍的影响。(A) Lon S845-1(IV、V和IV)或模拟转染细胞(I、II和III)用BFA处理16 h(II和V),暴露于缺氧48 h(III和VI),或在常压(I和III)下培养。用Mitosensor处理细胞后用显微镜研究线粒体膜电位TM公司15分钟。巴,15μm。(B) 计算显示线粒体膜电位信号的细胞数量,并将其表示为细胞总数的百分比。所示值为三个实验的平均值±SD*P(P)< 0.01.

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