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.2000年10月2日；192(7):1027-34.
doi:10.1084/jem.192.7.1027。

一个新的B7家族成员参与PD-1免疫抑制受体导致淋巴细胞活化负调控

G J弗里曼 1, A J龙, 伊瓦伊, K布尔克, T切尔诺瓦, H西村, L J菲茨, N马伦科维奇, T冈崎, M C Byrne先生, H F霍顿, L Fouser公司, L卡特, V玲, M R鲍曼, B M卡雷诺, M柯林斯, C R木材, T Honjo公司
附属公司

一个新的B7家族成员与PD-1免疫抑制受体的结合导致淋巴细胞活化的负调控

G J弗里曼等。 实验医学杂志. .

摘要

PD-1是一种免疫抑制受体，由活化的T细胞、B细胞和髓细胞表达。缺乏PD-1的小鼠表现出外周耐受性下降，并表现出多种自身免疫特征。我们在此报告PD-1配体（PD-L1）是B7基因家族的成员。PD-L1与PD-1的结合导致T细胞受体介导的淋巴细胞增殖和细胞因子分泌受到抑制。此外，PD-1信号可以抑制CD28介导的协同刺激的至少次优水平。PD-L1由抗原呈递细胞表达，包括干扰素γ刺激的人外周血单核细胞，以及活化的人和鼠树突状细胞。此外，PD-L1在心脏和肺等非淋巴样组织中表达。抗原提呈细胞上抑制性PD-L1和共刺激性B7-1/B7-2信号的相对水平可能决定T细胞激活的程度，从而决定耐受性和自身免疫之间的阈值。PD-L1在非淋巴组织上的表达及其与PD-1的潜在相互作用可能随后决定炎症部位的免疫反应程度。

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数字

图1
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鼠和人B7基因家族成员的氨基酸序列比对。相同的氨基酸用黑色框起来，保守的取代用灰色框起来。预测的信号域和跨膜域PD-L1型下划线。构成人体结合位点的氨基酸B7-1号机组用点表示（参考文献26）。人类（参考文献11）和小鼠（参考文献17和18）配体的序列国际博协(国际博协-L)之前已报告过。人和鼠的全长cDNA序列PD-L1型cDNA已分别以登录号AF233516和AF233517存放在EMBL/GenBank/DDBS。
图2
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PD-1与PD-L1的结合。（A） 稳定转染人或小鼠的CHO细胞PD-L1型或单独用hPD-1、Ig（γ2a）、mPD-1.Ig（γ1）、hCTLA-4.Ig（α2a），hCD28.Ig（α1）或hICOS对载体进行染色。Ig（γ2a）（物种匹配），并用山羊抗鼠IgG2a-PE或抗人IgG-FITC抗血清开发。（B） 在BIAcore 2000仪器上使用表面等离子体共振测试PD-L1.Ig与固定化mPD-1的结合。受体Fc融合蛋白通过与正常人血清胺偶联固定在CM5葡聚糖芯片上/N个-乙基-N个pH 4.0的10 mM醋酸钠中的′-（二甲胺基）丙基I碳化二亚胺盐酸盐（EDC），如所述（参考文献27）。mPD-1、Ig（γ1）的固定化蛋白量为5383个响应单位（RU），hPD-1.Ig（β1）的为5416个响应单位，hCTLA-4.Ig（γl）的为11493个响应单位。对来自hPD-L1。Ig（γ2a）转染细胞的浓缩COS调节培养基进行分析，在（+）或（-）共注射100μg/ml可溶性mPD-1.Ig、hPD-1.Ig/或hCTLA-4.Ig进行竞争。与注射前20秒确定的基线相比，注射结束后60秒的RU增加，从而量化了结合。
图2
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PD-1与PD-L1的结合。（A） 稳定转染人或小鼠的CHO细胞PD-L1型或单独用hPD-1、Ig（γ2a）、mPD-1.Ig（γ1）、hCTLA-4.Ig（α2a），hCD28.Ig（α1）或hICOS对载体进行染色。Ig（γ2a）（物种匹配），并用山羊抗鼠IgG2a-PE或抗人IgG-FITC抗血清开发。（B） 在BIAcore 2000仪器上使用表面等离子体共振测试PD-L1.Ig与固定化mPD-1的结合。受体Fc融合蛋白通过与正常人血清胺偶联固定在CM5葡聚糖芯片上/N个-乙基-N个pH 4.0的10 mM醋酸钠中的′-（二甲胺基）丙基I碳化二亚胺盐酸盐（EDC），如所述（参考文献27）。mPD-1、Ig（γ1）的固定化蛋白量为5383个响应单位（RU），hPD-1.Ig（β1）的为5416个响应单位，hCTLA-4.Ig（γl）的为11493个响应单位。对来自hPD-L1。Ig（γ2a）转染细胞的浓缩COS调节培养基进行分析，在（+）或（-）共注射100μg/ml可溶性mPD-1.Ig、hPD-1.Ig/或hCTLA-4.Ig进行竞争。与注射前20秒确定的基线相比，注射结束后60秒的RU增加，从而量化了结合。
图3
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的表达式PD-L1型在抗原提呈细胞和小鼠组织中。（A） Northern blot分析500 U/ml人IFN-γ、100 U/ml人类TNF-α或单独培养基刺激的人外周血单核细胞总RNA和抗-Ig激活的人B细胞与人PD-L1型,B7-1号机组,B7-2号机组和β-肌动蛋白cDNA探针。按照所述制备和刺激细胞（参考文献28）。行动。B、 放线菌素B（B）分离的人外周血树突状细胞（DC）在人GM-CSF中单独培养（灰色条）或在GM-CSF、LPS和IFN-γ（黑色条）中培养4或20 h，然后分离RNA进行定量（实时）PCR分析。荧光被绘制为PD-L1型,B7-1号机组，或B7-2号机组GAPDH信号。（C） 人与人角质形成细胞总RNA的Northern杂交分析PD-L1型cDNA探针。如前所述，分离角质形成细胞并用PMA和IFN-γ激活（参考文献10）。（D） 小鼠组织polyA的Northern印迹分析+鼠RNA（Ambion）PD-L1型cDNA探针。（E） 人类PD-L1型该基因通过PCR从含有所示人类染色体的单倍体体细胞杂交基因组DNA以及仓鼠、小鼠和人类基因组DNA中扩增。
图3
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的表达式PD-L1型在抗原提呈细胞和小鼠组织中。（A） Northern blot分析500 U/ml人IFN-γ、100 U/ml人类TNF-α或单独培养基刺激的人外周血单核细胞总RNA和抗-Ig激活的人B细胞与人PD-L1型,B7-1号机组,B7-2号机组和β-肌动蛋白cDNA探针。按照所述制备和刺激细胞（参考文献28）。行动。B、 放线菌素B（B）分离的人外周血树突状细胞（DC）在人GM-CSF中单独培养（灰色条）或在GM-CSF、LPS和IFN-γ（黑色条）中培养4或20 h，然后分离RNA进行定量（实时）PCR分析。荧光被绘制为PD-L1型,B7-1号机组，或B7-2号机组GAPDH信号。（C） 人与人角质形成细胞总RNA的Northern杂交分析PD-L1型cDNA探针。如前所述，分离角质形成细胞并用PMA和IFN-γ激活（参考文献10）。（D） 小鼠组织polyA的Northern印迹分析+鼠RNA（Ambion）PD-L1型cDNA探针。（E） 人类PD-L1型该基因通过PCR从含有所示人类染色体的单倍体体细胞杂交基因组DNA以及仓鼠、小鼠和人类基因组DNA中扩增。
图3
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的表达式PD-L1型在抗原提呈细胞和小鼠组织中。（A） Northern blot分析500 U/ml人IFN-γ、100 U/ml人类TNF-α或单独培养基刺激的人外周血单核细胞总RNA和抗-Ig激活的人B细胞与人PD-L1型,B7-1号机组,B7-2号机组和β-肌动蛋白cDNA探针。按照所述制备和刺激细胞（参考文献28）。行动。B、 放线菌素B（B）分离的人外周血树突状细胞（DC）在人GM-CSF中单独培养（灰色条）或在GM-CSF、LPS和IFN-γ（黑色条）中培养4或20 h，然后分离RNA进行定量（实时）PCR分析。荧光被绘制为PD-L1型,B7-1号机组，或B7-2号机组GAPDH信号。（C） 人与人角质形成细胞总RNA的Northern杂交分析PD-L1型cDNA探针。如前所述，分离角质形成细胞并用PMA和IFN-γ激活（参考文献10）。（D） 小鼠组织polyA的Northern印迹分析+鼠RNA（Ambion）PD-L1型cDNA探针。（E） 人类PD-L1型该基因通过PCR从含有所示人类染色体的单倍体体细胞杂交基因组DNA以及仓鼠、小鼠和人类基因组DNA中扩增。
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的表达式PD-L1型在抗原提呈细胞和小鼠组织中。（A） Northern blot分析500 U/ml人IFN-γ、100 U/ml人类TNF-α或单独培养基刺激的人外周血单核细胞总RNA和抗-Ig激活的人B细胞与人PD-L1型,B7-1号机组,B7-2号机组和β-肌动蛋白cDNA探针。按照所述制备和刺激细胞（参考文献28）。行动。B、 放线菌素B（B）分离的人外周血树突状细胞（DC）在人GM-CSF中单独培养（灰色条）或在GM-CSF、LPS和IFN-γ（黑色条）中培养4或20 h，然后分离RNA进行定量（实时）PCR分析。荧光被绘制为PD-L1型,B7-1号机组，或B7-2号机组GAPDH信号。（C） 人与人角质形成细胞总RNA的Northern杂交分析PD-L1型cDNA探针。如前所述，分离角质形成细胞并用PMA和IFN-γ激活（参考文献10）。（D） 小鼠组织polyA的Northern印迹分析+鼠RNA（Ambion）PD-L1型cDNA探针。（E） 人类PD-L1型该基因通过PCR从含有所示人类染色体的单倍体体细胞杂交基因组DNA以及仓鼠、小鼠和人类基因组DNA中扩增。
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的表达式PD-L1型在抗原提呈细胞和小鼠组织中。（A） Northern blot分析500 U/ml人IFN-γ、100 U/ml人类TNF-α或单独培养基刺激的人外周血单核细胞总RNA和抗-Ig激活的人B细胞与人PD-L1型,B7-1号机组,B7-2号机组和β-肌动蛋白cDNA探针。按照所述制备和刺激细胞（参考文献28）。行动。B、 放线菌素B（B）分离的人外周血树突状细胞（DC）在人GM-CSF中单独培养（灰色条）或在GM-CSF、LPS和IFN-γ（黑色条）中培养4或20 h，然后分离RNA进行定量（实时）PCR分析。荧光被绘制为PD-L1型,B7-1号机组，或B7-2号机组GAPDH信号。（C） 人与人角质形成细胞总RNA的Northern杂交分析PD-L1型cDNA探针。如前所述，分离角质形成细胞并用PMA和IFN-γ激活（参考文献10）。（D） 小鼠组织polyA的Northern印迹分析+鼠RNA（Ambion）PD-L1型cDNA探针。（E） 人类PD-L1型该基因通过PCR从含有所示人类染色体的单倍体体细胞杂交基因组DNA以及仓鼠、小鼠和人类基因组DNA中扩增。
图4
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TCR激活小鼠和人类T细胞PD-L1型结果抑制T细胞增殖和细胞因子生成。（A） 来自野生型（开放方形）和产品开发-1 −/使用不同浓度的预涂层抗CD3抗体（B）刺激−（填满圆圈）C57BL/6小鼠72小时。来自野生型（方形）和产品开发-1 −/用10μg/ml抗CD3单克隆抗体结合不同浓度的hPD-L.Ig（γ2a）（填充符号）或对照mIgG2a（开放符号）刺激−（圈）C57BL/6小鼠72小时。[三H] 胸苷掺入量测量一式三份。这些数据代表了四个单独的实验。（C） 纯化人CD4+用抗CD3单克隆抗体/对照IgG包被珠（斑点条）、抗CD3 mAb/hPD-L1、Ig（γ2a）包被珠状物（阴影条）或单独培养基（黑色条）刺激T细胞4天。珠/细胞比为1:1。扩散取决于[三H] 胸腺嘧啶掺入三孔。活化后96小时收集上清液，并使用商用ELISA试剂盒测量细胞因子浓度。这些数据代表了两个单独的实验。
图4
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TCR激活小鼠和人类T细胞PD-L1型结果抑制T细胞增殖和细胞因子生成。（A） 来自野生型（开放方形）和产品开发-1 −/使用不同浓度的预涂层抗CD3抗体（B）刺激−（填满圆圈）C57BL/6小鼠72小时。来自野生型（方形）和产品开发-1 −/用10μg/ml抗CD3单克隆抗体结合不同浓度的hPD-L.Ig（γ2a）（填充符号）或对照mIgG2a（开放符号）刺激−（圈）C57BL/6小鼠72小时。[三H] 胸苷掺入量测量一式三份。这些数据代表了四个单独的实验。（C） 纯化人CD4+用抗CD3单克隆抗体/对照IgG包被珠（斑点条）、抗CD3 mAb/hPD-L1、Ig（γ2a）包被珠状物（阴影条）或单独培养基（黑色条）刺激T细胞4天。珠/细胞比为1:1。扩散取决于[三H] 胸腺嘧啶掺入三孔。活化后96小时收集上清液，并使用商用ELISA试剂盒测量细胞因子浓度。这些数据代表了两个单独的实验。
图5
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CD28共刺激存在时TCR/PD-L1激活导致T细胞增殖抑制。纯化人CD4+用抗CD3单克隆抗体/对照mIgG包被珠（灰色条）或抗CD3 mAb/hPD-L1。在存在不同浓度可溶性抗CD28单克隆抗体的情况下，用Ig（γ2a）包被珠子（黑色条）刺激细胞4天。在抗CD3抗体的（A）次优浓度（1μg/ml）和（B）最佳浓度（2μg/ml）下进行刺激。珠/细胞比为1:1。扩散取决于[三H] 胸腺嘧啶掺入三孔。这些数据代表了两个单独的实验。
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