Hypoxia-inducible factor 1alpha protein expression is controlled by oxygen-regulated ubiquitination that is disrupted by deletions and missense mutations

doi:10.1073/pnas.080072497

.2000年4月25日；97(9):4748-53.

doi:10.1073/pnas.080072497。

低氧诱导因子1alpha蛋白表达受氧调节泛素化控制，泛素化被缺失和错义突变破坏

C H萨特¹, E笑声, G L塞门扎

附属公司

PMID： 10758161
预防性维修识别码：项目经理18304
内政部： 10.1073/pnas.080072497

低氧诱导因子1alpha蛋白表达受氧调节泛素化控制，泛素化被缺失和错义突变破坏

C H萨特等。美国国家科学院程序. 2000.

.2000年4月25日；97(9):4748-53.

doi:10.1073/pnas.080072497。

作者

C H萨特¹, E笑声, G L塞门扎

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院儿科和医学系遗传医学研究所，邮编21287-3914。

PMID： 10758161
预防性维修识别码：项目经理18304
内政部： 10.1073/pnas.080072497

勘误表in

对Sutter等人的修正，缺氧诱导因子1α蛋白的表达由氧调节的泛素化控制，该泛素化被缺失和错义突变破坏。
[未列出作者] [未列出作者] 美国国家科学院院刊2022年9月20日；119（38）：e2210922119。doi:10.1073/pnas.2210922119。Epub 2022年9月2日。美国国家科学院院刊，2022年。 PMID：36053737 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

缺氧诱导因子1（HIF-1）是一种转录因子，介导哺乳动物对O（2）可用性降低的细胞和系统稳态反应，包括血管生成、红细胞生成和糖酵解。HIF-1活性受O（2）调节的HIF-1α亚单位表达控制。在非缺氧条件下，HIF-1α蛋白会发生泛素化和蛋白酶体降解。在这里，我们报告了涉及HIF-1α几个不同区域的错义突变和/或缺失导致非缺氧细胞的组成性表达和转录活性。我们证明缺氧导致HIF-1α泛素化降低，错义突变通过阻断泛素化在非缺氧条件下增加HIF-1 alpha表达。

PubMed免责声明

数字

图1
C末端缺失对HIF-1α蛋白表达的影响。用编码HIF-1α结构的表达载体转染293个细胞，36小时后暴露于20%的O₂或1%O₂核提取物制备前缺氧4h。通过SDS/PAGE分离15微克等分样品，并使用抗HIF-1α抗体进行免疫印迹分析。分析的结构物编码以下HIF-1β残基：(A类) 1–826, 1–754, 1–681, 1–608; 和(B类) 1–729, 1–726, 1–703. 显示HIF-1α全长（FL）和缺失（Δ）形式的迁移(赖特).

图2
内部删除对O的影响摘要₂-HIF-1α表达的依赖性调节。总结了野生型（WT）或包含S551G/T552A错义突变的缺失结构的表达(赖特). 调节是指与非缺氧条件相比，缺氧条件下蛋白质表达增加。实验结果如图3和图4所示。

图3
错义突变对HIF-1α表达的影响（1–391/512–826）。(A类)用编码HIF-1α（1-391/512-826）（泳道1-2）、HIF-1α（1-391/512-826/C520M）（泳道3-4）或HIF-1α（1-391/521-826）（泳道5-6）的表达载体转染293细胞的核提取物的免疫印迹分析。(B类)分析转染空载体（EV；1–2道）或HIF-1α结构体的细胞的核提取物，该结构体由残基1–826（3–4道）或1–391/512–826组成，残基为野生型（5–6道）或含有S515A/S517A（7–8道）或Y519F（9–10道）错义突变。(C类)分析转染HIF-1α结构的细胞的核提取物，该结构由残基1–391/521–826（车道1–2）、1–391/1517–826，或1–391/2–826组成，这些残基为野生型（车道5–6）或含有P513G/P516G（车道7–8）或E512G/E518G（车道9–10）错义突变。(天)数据摘要。HIF-1α残基512-521的氨基酸（AA）序列以及错义突变和缺失（−）对O₂-显示了调节表达。

图4
内部缺失和错义突变对HIF-1α表达的影响。(A类)编码HIF-1α缺失结构的表达载体由1–391残基融合到429–826、494–826或508–826，野生型（WT）或含有S551G/T552A错义突变（MUT）的表达载体转染到293细胞中，并暴露于20%或1%的O₂持续4小时。制备核提取物，并对15μg等分试样进行免疫印迹分析，检测内源性全长（FL）和重组缺失（Δ）HIF-1α。用密度测定法定量缺失HIF-1α蛋白的表达。(B类)用pSVβgal和编码HIF-1α的载体（1–391/512–826）（1–2区）共同转染细胞，His₆-HIF-1α（1–391/512–826）（3–4车道），His₆-HIF-1α（1–391/512–826/S551G/T552A）（5–6车道）或His₆-HIF-1α（1–391/512–826/S551D/T552D）（7–8车道）。转染细胞暴露于20%或1%的O₂4小时后，通过金属亲和树脂结合从裂解液中纯化His标记蛋白。用抗HIF-1α多克隆抗体对纯化蛋白（归一化为β-gal表达）的等分样品进行免疫印迹分析，并用密度计定量蛋白质表达。

图5
缺失或错义突变对HIF-1α介导的报告基因转录的影响。用5μg pSVβgal、10μg p2.1（包含SV40启动子荧光素酶报告基因上游的缺氧反应元件）和125 ng表达载体转染Hep3B细胞，表达载体编码无蛋白（EV）、全长HIF-1α（FL）、带有S551G/T552A错义突变（MIS）的全长HIF-α或HIF-1β（1–391/521–826）（DEL）。转染细胞在20%O下培养₂测定荧光素酶：β-半乳糖活性比值，并将其归一化为转染空载体（EV）的细胞获得的值，以获得相对荧光素酶活性。结果显示了三个转染细胞平板的平均值和标准误差。

图6
GAL4/HIF-1α结构体的表达。用pSVβgal和编码GAL4 DNA-结合域（DBD）的表达载体转染COS细胞，并且没有额外的残基（1–2道）或HIF-1α氨基酸序列429–608，这些氨基酸序列要么是野生型（3–4道），要么包含S551G/T552A突变（5–6道）。转染细胞暴露于20%或1%的O₂制备裂解物，并用SDS/PAGE对60μg等分样品进行分级，并使用抗内源性HIF-1α抗体进行免疫印迹分析(顶部)或GAL4 DBD(中部). 隔离的GAL4 DBD(中部通道1–2）的迁移速度快于GAL4/HIF-1α融合蛋白，因此不在显示的免疫印迹部分内。通过密度测定法定量GAL4/HIF-1α融合蛋白的表达(底部).

图7
HIF-1α泛素化分析。(A类)293细胞与编码HIF-1α和无蛋白（泳道1-2）或His的表达载体共转染₆-泛素（3–4通道）。细胞暴露于20%或1%O₂4h，制备裂解物。用镍树脂孵育200微克的总蛋白等分样品，并用含有75 mM咪唑的缓冲液清洗。未纯化的等分试样(顶部)和镍树脂纯化(底部)用抗HIF-1α多克隆抗体对裂解产物进行SDS/PAGE和免疫印迹分析(B类)通过密度测定法量化3–4车道中HIF-1α的总水平和泛素化水平。测定泛素化/总HIF-1α的比率，并将其归一化为车道4中分析的裂解产物的结果，以得出相对HIF-1β泛素化。(C类)细胞共转染：pSVβgal；编码HIF-1α（1–391/512–826）的表达载体，其为野生型（WT；1–3道）或包含S551G/T552A错义突变（M；4道）；和不编码蛋白质（1–2道）或His的载体₆-泛素（3–4通道）。细胞暴露于20%或1%O₂4h，制备裂解物。用镍树脂孵育等分总蛋白（归一化为β-半乳糖），并用含有75 mM咪唑的RIPA缓冲液（0.15 mM NaCl/0.05 mM Tris-HCl，pH 7.2/1%Triton X-100/1%脱氧胆酸钠/0.1%SDS）清洗。未净化的小份(顶部)或树脂纯化(底部)用抗HIF-1α多克隆抗体对裂解产物进行免疫印迹分析(天)通过密度测定法对3–4车道中的总水平和泛素化野生型和突变型HIF-1α（1–391/512–826）进行量化。测定泛素化/总HIF-1α的比率，并将其归一化为车道4中分析的裂解物的结果，以得出相对HIF-1β泛素化。

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