实验-治疗-医学。2019年7月；18(1): 443–450.
多个Toll样受体的激活在脓毒症诱导的急性肺损伤中起着不同的作用
,1 ,1 ,2和2
陈新雷（Xinlei Chen）
1山东大学附属山东省医院麻醉科，山东济南，250000，中国
王婷婷
1山东大学附属山东省医院麻醉科，山东济南，250000，中国
梁松
2山东大学附属山东省医院胸外科，山东济南，250000，中国
刘向燕
2山东大学附属山东省医院胸外科，山东济南，250000，中国
1山东大学附属山东省医院麻醉科，山东济南，250000，中国
2山东大学附属山东省立医院胸外科，中国山东省济南市250000
2018年6月26日收到；接受2019年3月7日。
- 数据可用性声明
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
摘要
Toll样受体（TLR）的激活参与脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）后的固有免疫反应和急性炎症反应。越来越多的证据表明，败血症诱导的ALI可能与几种由微生物成分激活的异常TLR密切相关。然而，这一过程中涉及的TLR数量及其参与程度尚未完全阐明。目前的研究检测了与脓毒症诱导的ALI密切相关的四个TLR的同时激活。结果表明，与假手术组相比，盲肠结扎和穿孔（CLP）手术组TLR2/4/9的mRNA和蛋白表达水平显著升高。此外，TLR2−/−、TLR3−/−，TLR4级−/−和TLR9−/−采用C57BL/6小鼠建立CLP诱导的ALI动物模型，测定血浆和肺组织标本中TNF-α和IL-6的表达水平。TLR2中TNF-α和IL-6的表达均显著降低−/−，TLR4级−/−和TLR9−/−小鼠与WT小鼠进行比较。此外，研究结果表明，TLR2、4或9的敲低降低了免疫细胞的浸润，因此可能减轻肺损伤。此外，TLR2的总生存率显著增加−/−, 4−/−和9−/−CLP诱导的ALI小鼠与WT-CLP诱导的ALI小鼠的比较。然而，TLR3之间没有统计学意义−/−本研究中CLP诱导的ALI和WT-CLP诱导的ALI。综上所述，这些结果表明，在脓毒症诱导的ALI模型中，一些TLR上调并参与炎症反应。因此，同时抑制多个TLR，包括TLR2、9，尤其是TLR4，但不抑制TLR3，可能是治疗脓毒症诱导的ALI的潜在治疗靶点。
关键词：急性肺损伤、败血症、盲肠结扎和穿孔、Toll样受体、细胞因子
介绍
急性肺损伤（ALI）可由多种因素引起，给公共卫生带来负担，住院死亡率>40%(1,2). 炎症介质的过度生成导致内皮和上皮损伤，并导致血管渗漏、水肿和血管扩张，这些在ALI的发病机制中起着基础性作用(三,4). 脓毒症是微生物感染引起的全身炎症反应，是发病和死亡的主要原因(5). 肺部特别容易受到感染性炎症反应的影响，脓毒症是大多数患者ALI的根本原因(6). 因此，确定创新、安全和有效的治疗和预防方法对于治疗败血症诱导的器官损伤至关重要。
先天性免疫细胞激活主要依赖于Toll样受体（TLR），这是一个模式识别受体家族，可以识别特定的病原体相关分子模式（PAMP），包括核酸、蛋白质和脂质(7,8). TLR是先天免疫和适应性免疫的关键调节器，也是研究最深入的PRR之一(9). 迄今为止，已在哺乳动物中鉴定出10个以上的TLR家族成员，每个受体识别一组特定的PAMP(10). TLR2识别肽聚糖和脂磷壁酸，而TLR4识别脂多糖(11). TLR3识别内体内的双链RNA，而TLR9识别未甲基化的细菌CpG DNA(12——14). TLR3和9是细胞内受体，而TLR2和4是细胞表面受体(15). 然而，不同TLR的激活与产生的细胞因子（包括TNF-α和IL-6）诱导类似的促炎反应(16). TLR及其相关信号通路构成一个交错的网络，这使得识别新的治疗靶点变得复杂和困难(17). 此外，炎症通常是由多种PAMP引起的(18). 因此，一种疾病中可能激活多个TLR，这增加了潜在治疗策略的复杂性。因此，有必要确定哪些TLR参与炎症疾病的过程。
脓毒症是ALI的主要危险因素之一，有许多脓毒症动物模型，包括使用活菌和细菌制品(19——21). 盲肠结扎和穿刺（CLP）已成为脓毒症最广泛使用的模型，其中盲肠被结扎并用针穿刺三到五次，细菌产物中的PAMP可释放到血液中(22). CLP引起类似ALI的急性肺损伤；然而，CLP中的实际细菌接种物尚未确定(23). 来自这些模型的血液培养物通常对特定的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌呈阳性，其成分可以通过不同的TLR增加多种炎症细胞因子的产生，包括IL-6和TNF-α(24).
鉴于以往研究的结果，本研究的目的是研究不同TLR在脓毒症和脓毒症诱导的ALI中的作用。C57BL/6 WT、TLR2中CLP诱导的ALI模型−/−、TLR3−/−，TLR4级−/−和TLR9−/−建立C57BL/6小鼠。目前的研究表明，多个TLR可能参与脓毒症诱导的ALI的发病机制，TLR在这一过程中发挥着特殊作用。因此，需要研究同时抑制多个TLR激活的新治疗靶点。
材料和方法
动物
共有60个野生型（WT）和140个TLR基因敲除（TLR）−/−)，包括TLR2−/−、TLR3−/−，TLR4级−/−和TLR9−/−，C57BL/6雄性小鼠（8–10周；体重18–20 g）来自中国检验检疫研究院（中国北京）。所有小鼠均置于塑料笼中，温度为20–25°C，相对湿度为40–70%，光/暗循环时间为12小时。所有小鼠均饲养在山东大学附属省级医院医学研究中心实验动物中心（中国济南），并在特定的无激素条件下饲养，可免费获得食物和水。在随后的实验过程中，所有小鼠都被一氧化碳安乐死2所有实验程序均按照《国家和机构动物护理和使用指南》进行，并经山东大学动物伦理委员会（中国济南）批准。
CLP诱导的ALI模型
C57BL/6小鼠被分为六组：WT假手术组、WT CLP组、TLR2组−/−CLP、TLR3−/−CLP、TLR4−/−CLP和TLR9−/−CLP公司。CLP用于建立本研究中使用的ALI小鼠模型。在CLP程序中，小鼠禁食，在手术前只能自由饮水12小时。随后，用5%异氟烷（上海宇研仪器有限公司，中国上海）麻醉小鼠，并在70%N中维持1.5%异氟烷2O和30%O2使用小型动物麻醉机（Midmark Corporation，Kettering，OH，USA）。麻醉后，对皮肤进行消毒，并在腹部开一个正中切口，使盲肠暴露出来，然后从结肠根部和盲肠末端之间的中点穿过一条4-0编织丝线。将一根21号1英寸针头插入盲肠结扎中，挤压一小滴肠道内容物以诱导感染。最后，重新定位盲肠并闭合切口。假手术组打开腹部，暴露盲肠并重新定位，关闭切口。
逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）
术后20小时处死动物并分离肺部。使用TRIzol从肺样本中提取总RNA®试剂，根据制造商的协议（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）将总RNA逆转录成cDNA。使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 2X（Thermo Fisher Scientific，Inc.）和Mastercycle对mRNA表达进行qPCR评估®Realplex系统（德国汉堡Eppendorf）。引物对序列总结于使用内含子跨越引物、cDNA合成的逆转录酶阴性样品和每个反应获得的熔融曲线分析来检测qPCR质量和基因组DNA污染。放大条件如下：95°C（10秒），然后在55°C（20秒）、72°C（25秒）下进行40次循环。mRNA水平用2-∆∆Cq方法(25)并归一化为内部参考基因β-actin。结果与假手术组（CLP-induced sepsis）的值相关。
表一。
| 基因 | 引物序列（5′-3′） |
|---|
| TLR2级 | F： CGAGACTACCGCTGTGACTC公司 |
| R： CCTTCCTGGGCTCTCTCTT |
| TLR3级 | F： GGGACTGTTGACCTGTT公司 |
| R： GTTGGCTGTATCTCGTAA公司 |
| TLR4级 | F： TGCCTTCACTACAGGGACTT公司 |
| R： TGGGACACCACGAATAAC公司 |
| TLR9级 | F： CGTGACAATACTCTGGCCTTC公司 |
| R： CAGGCCTTCCAGCTGTTC（中国政府） |
| β-肌动蛋白 | F： 阿加加TCTCGACCGAGCG |
| R： TACTTGCGTGGAGGAGC（战术战术控制与控制） |
蛋白质印迹分析
根据制造商的协议，使用T-PER组织蛋白提取试剂盒从肺组织中提取总蛋白（Thermo Fisher Scientific，Inc）。总蛋白使用双钦酸（BCA）检测试剂盒（中国海门贝尤泰姆生物技术研究所）进行定量。然后将样品在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（每道20µg）上分离，并在冰浴中转移到PVDF膜上。在室温下用封闭溶液（5%非脂肪干乳）封闭非特异性部位2小时后，将膜与以下特异性一级抗体在4°C下孵育过夜：针对TLR2的一级抗体（1:1000；类别号ab213676；美国马萨诸塞州坎布里奇Abcam）、TLR3（1:500；类别号ab62566；Abcam；猫。编号ab13556；Abcam）和TLR9（1:500；目录号ab37154；Abcam）。然后在室温下用辣根过氧化物酶标记的IgG二级抗体（分类号A0208；1:2000；Beyotime生物技术研究所）培养样品1小时。化学发光液体（类别号WBKLS0100；EMD Millipore）以1:1的比例制备。使用ChemiDoc XRS+系统（Bio-Rad，CA，USA）定量并扫描蛋白质表达，以GAPDH（1:500；cat.no.ab8245；Abcam）作为负荷控制。最后，使用Image J软件（v1.8.0；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）量化带密度。
酶联免疫吸附试验
根据制造商的协议，使用从eBioscience（Thermo Fisher Scientific，Inc.）获得的ELISA试剂盒，对小鼠血浆和肺组织样本进行TNF-α（cat.no.88-7324-22）和IL-6（cat.no.88-7064-88）表达分析。
支气管肺泡灌洗液（BALF）样本的采集
如前所述，支气管肺泡灌洗后从小鼠中采集BALF样本(26). 简单地说，对小鼠进行麻醉，暴露肺部。气管插管，肺部用0.8 ml生理盐水冲洗两次。收集BALF样品，并在4°C下以800×g离心10 min，去除上清液，并在−80°C下储存，直至再次使用。重新悬浮细胞颗粒，并使用血细胞仪测定细胞总数。在Hemavet 950仪器（Drew Scientific Inc.，Miami Lakes，FL，USA）上对BALF样本中的白细胞总数进行计数，并将其分为五类，包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。使用BCA检测试剂盒（贝尤泰姆生物技术研究所）定量BALF样品中的总蛋白。
血红素和曙红（H&E）染色
将CLP诱导的ALI小鼠20 h的肺组织样品在22°C的10%福尔马林中固定≥24 h，并包埋在石蜡中。将石蜡包埋组织样品切割成5µm厚的切片。随后对组织切片进行脱蜡并用苏木精-赤藓红-藏红花染色，并在光学显微镜下观察形态学变化（放大倍数，×200）。两名独立的病理学家根据以下四项对肺损伤进行评分：肺泡充血、出血、中性粒细胞在空气空间或血管壁的浸润或聚集，以及肺泡壁或透明膜形成的厚度。每个项目都根据四分制评分：0=最小损伤/看起来正常；1=轻度损坏；2=中度损坏；3=严重损坏；4=最大损伤。总肺损伤评分通过将每个类别的个人评分相加来计算，范围从0到16（最严重）。
死亡率
对于生存研究，在CLP或假手术后每天监测每只小鼠7天。每24小时观察一次生存情况，持续7天。
统计分析
数据表示为平均值的平均值±标准误差。所有统计分析均使用SPSS软件（版本17.0；SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行。采用独立样本t检验分析两组间的统计差异。采用单因素方差分析和Fisher最小显著性差异事后检验分析多组间的差异。使用Kaplan-Meier方法分析总体生存率，并使用log-rank方法比较各组之间的1周生存率分布。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
CLP诱导ALI后肺组织TLR2、4和9 mRNA和蛋白表达水平增加
CLP是最广泛使用的败血症模型，细菌产物中的多个PAMP释放到血液中(27). CLP诱导的ALI模式可用于识别上调的TLR，其由PAMP调节。为了检测TLR2、3、4和9在CLP诱导的ALI中的表达，从WT和CLP诱导ALI小鼠的肺组织中分离总RNA和蛋白。与假手术组相比，CLP手术组TLR2、4和9的mRNA表达水平显著增加(). 同样，与假手术组相比，CLP手术组TLR2、4和9的蛋白表达水平增加(). 然而，与假手术组相比，CLP手术组TLR3的mRNA和蛋白表达水平没有显著变化(). 这些结果表明，CLP诱导的ALI中的PAMPs可诱导TLR2、4和9 mRNA和蛋白表达。
CLP诱导的ALI后，小鼠肺组织TLR2、4和9 mRNA和蛋白表达水平增加。将WT C57BL/6雄性小鼠分为两组：CLP组和假手术组，术后20小时分离肺部。通过RT-qPCR和western blot分析分别测定TLR2、4和9的相对（A）mRNA和（B）蛋白表达水平。数据表示为平均值的平均值±标准误差（n=5）**与假手术组相比P<0.01。TLR、T类醇样受体；盲肠结扎和穿孔；急性肺损伤；WT，野生型；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应。
TLR2、9和4增加了CLP诱导的ALI中细胞因子的产生
为了研究TLR在CLP诱导的ALI炎症反应中的作用，我们检测了TLR缺乏小鼠和WT小鼠的炎症反应。分析小鼠血浆和肺组织样本的TNF-α和IL-6表达。与假手术小鼠相比，CLP诱导的ALI WT小鼠血浆中TNF-α和IL-6的表达水平显著升高(). 此外，CLP诱导的ALI TLR缺陷小鼠血浆中TNF-α和IL-6的表达水平与假手术小鼠相比显著升高(). 然而，与CLP诱导的ALI WT小鼠相比，TLR2-、4-和9-缺陷小鼠CLP诱导ALI血浆中TNF-α和IL-6的表达水平显著降低。此外，与CLP诱导的ALI WT小鼠相比，TLR3缺陷小鼠CLP诱导ALI血浆中TNF-α和IL-6的表达水平没有差异。同样，在肺组织样本中也观察到血浆中TNF-α和IL-6表达水平的趋势(). 这些结果表明，包括TLR2、4和9在内的一些TLR可能会增加CLP诱导的细胞因子产生并加重ALI，但TLR3可能不会。
TLR缺乏小鼠CLP诱导的ALI中TNF-α和IL-6表达降低。WT和TLR缺陷的C57BL/6小鼠接受CLP手术。术后20小时用ELISA检测（A）血浆和（B）肺组织中TNF-α和IL-6的表达。数据表示为平均值的平均值±标准误差（n=5）。#与WT假手术组相比P<0.05**与WT-CLP组相比，P<0.01。肿瘤坏死因子-α；IL-6、IL-6；盲肠结扎和穿孔；急性肺损伤；TLR、T类醇样受体；WT，野生型。
敲低TLR2、4或9可减轻肺损伤
CLP诱导的肺损伤的主要特征是低氧血症、免疫细胞浸润以及间质和肺泡水肿。在CLP诱导的ALI组中，与假手术组相比，BALF细胞总数（包括中性粒细胞和巨噬细胞）以及蛋白质浓度增加(). 然而，与CLP诱导的ALI WT小鼠相比，CLP诱导ALI TLR2-、4-和9-缺陷小鼠的BALF细胞总数以及BALF中性粒细胞和巨噬细胞计数显著降低(). 此外，与CLP诱导的ALI WT小鼠相比，CLP诱导ALI TLR2-、4-和9-缺陷小鼠的BALF蛋白浓度显著降低().
CLP诱导的WT和TLR急性肺损伤中免疫细胞浸润和肺损伤−/−老鼠。从WT和TLR收集BALF样品−/−术后20小时检测各组小鼠的（A）总数、（B）PMN和（C）巨噬细胞计数。（D） 检测BALF蛋白浓度。（E） 肺组织切片H&E染色后观察形态学变化（放大倍数×200）。比例尺，200µm。来自至少三个独立实验的数据。（F） 检查CLP诱导的肺损伤评分。数据表示为平均值的平均值±标准误差（n=5）。#与WT假手术组相比P<0.05**与WT-CLP组相比，P<0.01。盲肠结扎和穿孔；急性肺损伤；WT，野生型；TLR，Toll样受体；PMN，多形核细胞；支气管肺泡灌洗液；H&E、苏木精和曙红。
H&E染色肺切片显示，与假手术组相比，CLP诱导的ALI WT组存在大量浸润性炎症细胞(). 此外，与假手术组相比，CLP诱导的ALI WT组的肺损伤评分显著增加(). 然而，与CLP诱导的ALI WT组相比，CLP诱导ALI TLR2-、4-和9-缺陷小鼠的浸润性炎症细胞数量减少，肺损伤评分显著降低(). 相比之下，CLP诱导的ALI TLR3缺乏小鼠的病理损伤没有改善，肺损伤评分与CLP诱导ALI组相比没有统计学差异(). 综上所述，这些结果表明，TLR2和9，尤其是TLR4的下调可能减轻CLP诱导的ALI的肺损伤。
TLR2、4和9的表达增加了CLP诱导的ALI小鼠的死亡率
为了研究TLR对CLP诱导的ALI死亡率的影响，我们检测了TLR缺陷小鼠和WT小鼠的总生存率。与假手术组相比，CLP诱导的ALI WT组的总生存率显著降低；然而，与CLP诱导的ALI WT小鼠相比，CLP诱导ALI TLR2-、4-和9-缺陷小鼠的总存活率显著增加(). CLP诱导的ALI TLR3缺陷小鼠与CLP诱导ALI WT小鼠之间无统计学差异。这些结果表明TLR2、4和9增加了CLP诱导的ALI小鼠的死亡率。
CLP诱导的WT和TLR急性肺损伤的总生存率−/−老鼠。CLP诱导WT和TLR急性肺损伤后Kaplan-Meier生存曲线−/−小鼠（n=15）。采用log-rank方法比较不同组之间的1周存活率分布**与WT-CLP组相比，P<0.01。野生型WT；盲肠结扎和穿孔；TLR，Toll样受体。
讨论
虽然TLR的激活对先天免疫系统至关重要，并在宿主抵抗入侵微生物的防御机制中发挥作用，但TLR的过度激活参与了几种炎症疾病的发病机制(28). 急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是ALI的最严重形式，由脓毒症、大手术和创伤等多种危险因素引起的严重全身炎症反应引起(29). 严重感染和严重创伤导致炎症介质的全身释放和继发的间接肺损伤(30).
先天免疫反应提供抵抗入侵病原体的保护，并依赖PRR识别保守的微生物基序或PAMP(31). TLR是在哺乳动物中发现的首批PRR的主要家族之一，在免疫细胞上表达，包括DC、巨噬细胞和B细胞，以及特定的非免疫细胞，包括内皮细胞和上皮细胞(32). 此外，TLRs 1–10主要在肺组织中表达(33)在特定的肺细胞群中，个体TLR可以受到微生物刺激的不同调节(34). 特异性TLR的激活可导致多种促炎细胞因子的表达，包括TNF-α、IL-6、IL-12和IFN(35).
虽然之前的研究已经调查了TLR与脓毒症或ALI的关系，但目前的研究是首次同时检测多个TLR，并比较它们在脓毒症诱导的ALI中的潜在作用(36). 本研究建立了CLP诱导的急性肺损伤小鼠模型，以检测TLR2、3、4和9四种TLR对脓毒症诱导的急性肝损伤的影响。CLP脓毒症模型因其高稳定性、良好的重复性和广泛的适用性，目前被视为脓毒症相关研究的金标准(37). 本研究采用CLP诱导的ALI小鼠模型，检测肺急性炎症反应过程中TLR2、3、4和9 mRNA和蛋白表达的细胞变化。本研究结果表明，与假手术组相比，CLP手术组TLR2、4和9的mRNA和蛋白表达水平显著增加，这些TLR的激活也增加了CLP诱导的ALI小鼠的细胞因子生成和死亡率。然而，TLR3的mRNA和表达蛋白水平没有显著影响。总之，这些结果表明TLRs 2、4和9可能参与ALI的发病机制。此外，敲低TLR2和9，尤其是TLR4，可以减轻肺损伤。在当前研究中，TLR2−/−，第3页−/−, 4−/−和9−/−小鼠实验表明，敲除TLR2、4和9显著增加TNF-α和IL-6的表达水平，而敲除TLR3显著降低TNF-β和IL-6表达水平。此外，TLR2中浸润的炎性细胞数量减少−/−, 4−/−和9−/−与CLP诱导的ALI WT小鼠相比，CLP诱导ALI小鼠的肺损伤评分显著降低。此外，TLR2的总生存率显著增加−/−, 4−/−和9−/−CLP诱导的ALI小鼠与WT-CLP诱导的ALI小鼠的比较。
尽管支持性护理有所改善，但急性肺损伤仍是重症监护病房发病率和死亡率的主要原因(6,38). TLR信号通路的抑制可能是ALI/ARDS的有效治疗靶点。有几种TLR拮抗剂，其中大多数只能抑制单个TLR的激活。此外，目前的治疗策略对改善ALI/ARDS患者的总体生存率影响有限(39——41). 因此，需要研究同时抑制多个TLR激活的新治疗靶点。本研究首次同时检测多个TLR，并比较其在脓毒症诱导的ALI中的潜在作用，这可能用于改进潜在治疗靶点的筛选。
总之，目前的研究表明，在CLP诱导的ALI小鼠肺组织样品中，TLR2、4和9的mRNA和蛋白表达水平显著增加。此外，多个TLR，包括TLR2和9，尤其是TLR4，显著增加了CLP诱导的细胞因子生成并加重了ALI。目前的研究表明，敲低TLR2、4或9可减轻肺损伤，TLR2的总生存率显著提高−/−, 4−/−和9−/−CLP诱导的ALI小鼠与WT CLP诱导的ALI小鼠相比。综上所述，这些结果表明多个TLR可能参与脓毒症诱导的ALI的发病机制。因此，同时抑制多个TLR，包括TLR2、9，尤其是TLR4，但不抑制TLR3，可能是治疗脓毒症诱导的ALI/ARDS的潜在治疗靶点。
数据和材料的可用性
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
作者的贡献
XC和XL构思了这个项目。XC和TW设计了实验。XC、TW和LS进行了实验。XC分析了数据。XC和XL准备了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
道德批准和参与同意
所有实验程序均按照《国家和机构动物护理和使用指南》进行，并经山东大学（中国山东）动物伦理委员会批准。
工具书类
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