甘草次酸通过调节Ras/MAPK和PI3K/Akt途径之间的平衡改善胰岛素反应途径
2019年1月25日收到；2019年3月9日验收。
- 补充资料
GUID:A4C6661F-DE87-438D-953C-32829F750929
摘要
据报道，甘草次酸（GA）是人类饮食中的一种生物活性成分，可改善代谢综合征大鼠的高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗和肥胖。然而，GA-特异性靶蛋白以及下游信号传导和串扰改善胰岛素敏感性的机制尚未完全阐明。在本研究中，利用用于靶捕获和细胞分子成像的串联GA探针，通过化学蛋白质组学策略确定GA的潜在靶点。细胞内酶活性评估和胰岛素抵抗模型用于验证靶蛋白在下游胰岛素信号通路上的功能。总之，我们的数据表明，GA通过激活HepG2细胞中胰岛素信号通路的多种糖尿病因素改善了胰岛素反应途径和葡萄糖消耗水平。GA通过靶向Ras蛋白来调节有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，从而提高葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达。在用蛋白激酶C（PKC）激活剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）处理的细胞中，GA对IRS1ser307磷酸化表现出强烈的抑制作用。在游离脂肪酸（FFA）处理的HepG2细胞中，GA也抑制IRS1ser307磷酸化。GA还抑制PMA诱导的IκB激酶α/β（IKKα/β）、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38蛋白（p38）的磷酸化，表明IKKα/β、JNK和p38的激活依赖于PKC活性。
关键词：甘草次酸、胰岛素抵抗、串扰、Ras/MAPK、PI3K/AKT
1.简介
胰岛素抵抗导致靶组织无法对正常水平的循环胰岛素作出适当反应，这是一种常见的病理状态，称为2型糖尿病（T2DM）。当胰岛素与其同源受体（跨膜酪氨酸激酶受体）结合时，会导致胰岛素受体（IR）的自磷酸化和活化。激活的IR磷酸化几个胰岛素受体底物（IRS）蛋白家族。IRS蛋白（IRS-1至IRS-4）在胰岛素信号传导中起关键作用[1]. 例如，IRS-1的功能是多方面的，涉及IRS-1在多个丝氨酸/苏氨酸残基上的磷酸化[2]. 最近的研究表明，糖尿病因素，如游离脂肪酸（FFA）[三]，肿瘤坏死因子-α[4]高胰岛素血症、IRS-1丝氨酸磷酸化增加和ser307/612/632被鉴定为磷酸化位点[2,5]. 关键位点的磷酸化，如IRS1ser307，代表了关键靶点。IRS1ser307位点的重要性在于它参与高胰岛素血症或急性脂质输注时的胰岛素抵抗[6,7]. 因此，IRS-1在ser307的磷酸化被认为是胰岛素信号传导和胰岛素抵抗的主要参与者。
胰岛素信号传导已经研究多年，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT和Ras/MAPK通路在IRS下游起主要作用[8]. 激活MAPK信号级联下调葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）的表达，导致葡萄糖转运减少。PI3K/Akt途径在调节胰岛素代谢中起着关键作用，尤其是通过胰岛素敏感的GLUT4增加葡萄糖摄取[9]. 此外，Ras/MAPK和PI3K/Akt通路之间的相互作用调节葡萄糖和脂质的代谢并导致氧化应激[10]. 两种途径的异常都会导致糖脂代谢异常，这是T2DM的主要病理生理特征[11].
甘草的根和根茎(光滑甘草林恩）该物种被广泛用作天然甜味剂和草药。甘草次酸（GA）是一种三萜皂苷，是甘草根的主要生物活性成分，具有抗炎、降糖和抗肿瘤的药理作用[12]. 先前的研究表明，GA通过选择性诱导组织脂蛋白脂肪酶（LPL）的表达，抵消了内脏肥胖的发展，改善了血脂异常[13]. GA逆转胰岛素抵抗，可能是通过降低己糖-6-磷酸脱氢酶（H6PDH）和11β-羟基甾醇脱氢酶-集型1（11β-HSD1），选择性降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性[14]. GA改善高脂饮食肥胖大鼠LPL表达、脂质沉积和血脂[15]. GA还通过调节Akt和激素敏感脂肪酶（HSL）磷酸化来显示抗脂肪生成和促脂多糖作用[16]. 然而，GA改善胰岛素抵抗并调节血糖和脂质代谢的准确蛋白质靶点和分子机制尚不清楚。
在本研究中，使用合成GA探针进行点击反应、鱼竿和细胞分子成像，通过化学生物学策略确定GA的潜在靶点。细胞内酶活性评估和胰岛素抵抗模型验证了潜在靶蛋白对下游胰岛素信号通路的作用。结果表明，GA影响Ras GTPases和PKC的作用，调节Ras/MAPK和PI3K/Akt信号通路之间的串扰，促进GLUT4表达，减轻炎症反应，改善胰岛素敏感性。
2.材料和方法
2.1. 动物
从军事医学科学院实验动物实验中心（SCXK2012-0004，中国北京）购买6周龄雌性昆明种小鼠，体重20–25 g（无特定病原体（SPF））。根据南开大学临床前研究伦理委员会批准的方案，使用实验动物进行研究。将小鼠随机分为4组(n个=每组10只小鼠）。三组均每日胃内（i.g）给予GA（高剂量，100 mg/kg；中剂量，50 mg/kg，低剂量，25 mg/kg），持续14天，而对照组则每日腹腔注射生理盐水（0.5 mL/天）。在两周的治疗期内，给小鼠喂食小鼠饲料。采用眼眶后静脉丛入路采集血样，测定血糖、糖皮质激素、胰岛素、IL-6和TNF-α水平，并用ELISA试剂盒测定。ELISA试剂盒购自检测公司（中国北京）。膜和细胞质蛋白提取试剂盒以及BCA蛋白测定试剂盒购自Beyotime Biotechnology Corporation（中国上海）。
2.2. 试剂、细胞培养、SDS-PAGE和蛋白质印迹
HepG2（肝细胞癌细胞）细胞系取自美国型培养物收集中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。HepG2细胞系保存在添加10%的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中(v（v）/v（v）)胎牛血清和100单位/mL青霉素，在37°C和5%CO中培养2大气。根据制造商建议的膜和细胞质蛋白提取试剂盒方案获得蛋白裂解物，并使用BCA蛋白检测试剂盒（中国北京索拉比奥）检测蛋白质浓度。如前所述进行western blot和SDS-PAGE分析[17]. 铁三O（运行）4氨基磁性微球（MMs）购自天津基线铬技术研究中心（中国天津）。一级抗体抗Ras（#3965）、抗P38（#9212）、抗磷蛋白P38（#9211）、抗JNK（#9252S）、抗磷酸蛋白JNK、抗GADPH（#2118）和山羊抗兔IgG（#7074）二级抗体购自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）。抗-PKC（ab179521）、抗HSD11B1（ab39364）、抗AKT（ab393654）、抗磷-AKT（473）（ab81283）、抗GSK3β（ab93926）、抗磷-GSK3β（ab131097）抗IKKα/β（ab178870）、抗磷酸-IKKα-β（ab17943）和Alexa Fluoro 594-结合山羊抗兔IgG（ab150084）抗体购自英国剑桥的Abcam。Anti-GLUT4（bS3680）购自Bioworld（明尼苏达州明尼苏里州，美国）。Anti-IRS1（phospho-ser307）（bs-2736R）、Anti-IRS1（bs-0172R）购自Bios（中国北京）。佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）购自YEASEN（中国上海）。farnesyltransferase（FTase）抑制剂tipifarnib（Tip）和PKC抑制剂bisindolylmalemide I（GF109203X）购自Selleck（美国德克萨斯州休斯顿）。甘草次酸（纯度>98.5%，通过HPLC测定）和丙炔胺购自J&K Chemical（中国北京）。
2.3. 靶蛋白在细胞中的富集
HepG2细胞维持在75厘米2培养瓶和用10µM炔基-GA探针培养6h。用预冷PBS洗涤三次后，向培养物中添加500µL裂解缓冲液（中国北京索拉比奥），并将细胞在冰上培养30min。然后用GA修饰的功能化磁性微球（探针1）处理细胞裂解液并与催化剂（2.0 mM抗坏血酸钠和1.0 mM CuSO）孵育4在预冷PBS中）在4°C下过夜，以捕获炔基-GA探针的目标。然后，用磁铁分离探针1，并用PBS清洗。然后用中等浓度的DL-二硫苏糖醇（DTT）（100 mM）在37°C下处理富集的探针1 1 h，以释放捕获的蛋白质靶点，然后使用SDS-PAGE和随后的western blotting对其进行鉴定，根据之前报告的方法进行[17].
2.4. 靶蛋白的Colocalization和GA
将HepG2细胞接种在烧瓶中，并用1µM炔基-GA探针处理6 h。用4%多聚甲醛清洗并固定细胞，然后用10%山羊血清封闭。添加抗Ras（1:1000）和抗PKC（1:500）抗体，并在4°C下培养过夜。然后，向细胞中添加Alexa Fluor 594结合二级抗体（1:1000），并在室温下培养1小时。然后将N3-标记底物（10µM）添加到细胞中，以与上述催化剂系统进行探针2点击反应，并在37°C下培养1 h。经过足够次数的清洗后，用共焦显微镜（日本徕卡TCS SP8）获得荧光图像：Alexa Fluor594：激发波长：594，发射波长：617 nm；探头2：激发波长488，发射波长520nm。采用DAPI（1:1000）染色细胞核，并在激发波长：405和发射波长：430nm处拍摄图像。
2.5. RAS激活评估
根据制造商的说明，使用New East检测试剂盒（中国武汉NewEast Biosciences）检测Ras。简言之，用GA（0.2、20或20µM）刺激约80-90%的融合培养细胞（10-cm板）6小时。然后，抽吸培养基，向细胞中添加500µL分析/裂解缓冲液，并在冰上培养10-20分钟。通过离心10分钟（12000分钟）澄清裂解液·克，温度为4°C）。GTPγS-和GDP-结合蛋白分别作为阳性和阴性对照。将细胞提取物分为两管，并添加20µL 0.5 M EDTA。向阳性对照添加5微升GTPγS，向阴性对照添加5µL GDP。将试管在30°C下孵育30分钟，并通过将试管置于冰上，然后加入60mM氯化镁来终止装载2然后，将抗活性Ras单克隆抗体（1µL）添加到每个试管中。将重新悬浮的珠浆快速添加到每个管中。然后，在4°C下轻轻搅拌试管1小时。在5000℃下离心1分钟，制成小球·克.吸取上清液并丢弃，用分析/裂解缓冲液清洗珠子3次。在SDS-PAGE和western blot分析之前，将试管煮沸5分钟。
2.6. PKC激酶活性检测试剂盒
PKC激酶活性检测试剂盒（ab139437）用于PKC检测。遵循制造商的说明。首先，在从所有孔中吸取液体后，在室温下向每个孔中添加50µL激酶活性测定缓冲液10分钟。然后，添加30µL样品，向每个孔添加10µL重组ATP，并在30°C下培养30分钟。通过清空每个孔的内容物停止反应。随后，在室温下向每个孔中添加40µL PKC磷特异性底物抗体60 min，并向每个孔添加洗涤缓冲液三次。然后，添加40µL稀释的抗兔IgG-HRP结合物，在室温下培养30 min，并向每个孔中添加洗涤缓冲液三次。最后，向每个孔中添加60µL TMB基板，并向每个孔添加20µL停止溶液。在外径=450 nm的微孔板阅读器上测量吸光度增加。
2.7. 统计分析
结果报告为平均值±标准偏差（S.D.）。一个未成对的双尾学生的t吨-两组的统计比较采用检验，多重比较采用带Bonferroni校正的单因素方差分析。所有数据均使用GraphPad Prism统计软件5.01版（GraphPad-software，San Diego，CA，USA）进行处理。
3.结果
3.1. GA影响全身胰岛素反应途径
新的数据表明，GA可以通过改善胰岛素敏感性来对抗T2DM的发展[14]. 我们的结果与文献一致，因为与对照组相比，GA的给药依赖于剂量且显著激活小鼠糖皮质激素(a） ●●●●。与对照组小鼠相比，所有治疗组小鼠的血糖和胰岛素水平均较低(b、 c）。此外，炎症因子IL-6和TNF-α被显著抑制，特别是在高剂量组(d、 e）。如所示随着GA发挥糖皮质激素样作用，胰岛素反应途径改善，葡萄糖生成减少。为了解释这一现象，我们进行了以下实验来探索胰岛素信号通路中的GA靶蛋白。
GA影响全身胰岛素反应途径。(一——e（电子）)GA给药后空腹血浆糖皮质激素（GC）、胰岛素（INS）、葡萄糖（GLU）、IL-6和TNF-α浓度。用生理盐水0.5 mL/天（对照组）或GA（高，100 mg/kg；中，50 mg/kg，低，25 mg/kg）治疗小鼠。检测结果为平均值±S.D(n个= 10). *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页与对照组相比<0.001。
3.2. 遗传算法目标的预测与验证
为了阐明GA改善胰岛素抵抗的靶点，我们首先完成了GA的反向对接。GA的3D结构是使用ChemBio3D Ultra 13.0软件（PerkinElmerInc.，San Diego，CA，USA）以sdf格式制备的，并提交给Pharm Mapper服务器(http://59.78.96.61/pharmapper网站/)仅在最大生成构象设置为300的情况下选择人蛋白靶标。接下来，选择前20个候选目标，通过字符串10.0分析候选交互(网址：http://www.string-db.org/). 如所示A、 强烈推荐胰岛素相关信号通路中的三个靶点，即HRAS、PRKCA（PKCα）和MAP2K1（MEK1）（蓝色圆圈）。此外，还预测了甾体激素生物合成信号通路中的两个靶点HSD11B1和HSD17B1（红圈）。然后使用AutoDock 4.2软件（Olson Laboratory，LaJolla，CA，USA）进行分子对接，以评估抗糖尿病靶点和GA之间的相互作用。GA显示HRAS、PKCα、MEK1、HSD11B1和HSD17B1靶点的不同分数，分别显示为−7.47、−8.97、−9.93、−10.31和−10.12 kcal/mol(表S1).
GA目标的预测和验证(A类)GA与Pharm Mapper和String 10.0预测的靶蛋白的相互作用和功能分析。(B类)炔基修饰GA（炔基-GA）、功能化磁性微球（Probe1）和荧光点击产物（Probe2）的合成。(C类)用SDS-PAGE（左面板）和western blotting（右面板）检测Probe1对靶蛋白富集的捕获能力。通道1包括HepG2裂解物作为装载控制；第二道，用非GA探针修饰的微球作为阴性对照品进行捕捞裂解物；通道3，由Probe1捕获并释放蛋白质。在捕鱼之前，所有蛋白质样品的细胞裂解物浓度均相同，并将相同的样品用于蛋白质印迹。(D类)共焦荧光显微镜下炔基-GA、RAS和PKC蛋白的定殖分析。(E类)使用下拉系统确认GA在0.2、2和20μM时抑制HepG2细胞中GTP结合的结合。(F类)GA对HepG2细胞PKC活性的影响。检测结果为平均值±S.D(n个= 3), (*第页< 0.05, **第页< 0.01,###第页< 0.001).
为了识别预测的靶点，合成了一组化学探针来定位和捕获上述靶蛋白。炔基-GA、Probe1和Probe2的合成路线如补充数据（图S1–S5）.英寸B、 使用GA修饰的功能化MMs（探针1）捕获HepG2细胞中的靶蛋白。采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测定收集效率。结果表明，探针1从HepG2细胞的裂解液中富集了一些蛋白质(C、 但在阴性对照组中，非GA修饰探针-MM仅显示轻微的蛋白质检测(C、 左侧面板通道2）。这一结果表明，钓竿策略通过Probe1选择性地丰富和释放了相关目标。接下来，一个western blot进一步证实，与阴性对照组相比，RAS、PKC和HSD11B1可能是显著富集的靶点(C） ●●●●。这些结果表明，Ras和PKC可能是GA在胰岛素相关信号通路中的潜在靶蛋白。此外，Probe2被用于HepG2细胞中Ras和PKC蛋白的细胞化学共定位染色。如所示D、 Alkynyl-GA（1µM）荧光在细胞质（绿色）中明显，Alexa Fluor594二级抗体（红色）染色的Ras分布在细胞质和膜中，并与Alkynly-GA（黄色）部分融合，如箭头所示。
通常，GTP结合会增加Ras的活性，GTP水解为GDP会使其失去活性。在我们的研究中，我们使用基于构型特异性抗Ras-GTPγS单克隆抗体的Ras活化检测试剂盒来测量活性Ras-GTP水平和被蛋白a/G琼脂糖拉下的沉淀活性Ras，如使用抗Ras抗体的免疫印迹分析所检测到的。如所示E、 20μM GA显著抑制GTP-结合Ras的分子间相互作用和对HepG2细胞的激活。这一结果表明，GA抑制了与GTP结合的Ras的相互作用以及Ras在HepG2细胞中的激活作用。此外，为了确定GA对PKC的抑制作用，我们检测了HepG2细胞中PKC的激活。如所示F、 PKC特异性激动剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）的刺激使PKC活性升高，加入10μM GA后，这种作用显著减弱。上述结果表明，GA可能作用于RAS和PKC靶点并影响其下游功能。
3.3. GA对葡萄糖消耗和胰岛素反应途径的影响
新出现的数据表明，诱导胰岛素抵抗的TNF-α、FFA和高胰岛素血症激活IRS-1上的er307磷酸化并抑制其功能。因此，我们使用胰岛素刺激的HepG2细胞激活胰岛素信号通路。当胰岛素信号通路被激活时，葡萄糖消耗量下降。然而，GA以剂量依赖性的方式改善了葡萄糖消耗水平，这与二甲双胍组相似(A） ●●●●。为了进一步阐明GA在分子水平上的作用，用5和10μM GA隔夜处理胰岛素刺激的HepG2细胞，并评估下游通路的磷酸化水平。如所示B、 胰岛素刺激HepG2细胞显示模型组IRS1ser307升高，AKTser473降低。相反，GA抑制IRS1ser307的磷酸化激活，并增加AKTser473的磷酸化。
GA对葡萄糖消耗和胰岛素反应途径的影响。(A类)GA对激活的胰岛素信号通路中葡萄糖消耗的影响。(B类)胰岛素刺激HepG2细胞中AKTser473和IRS1ser307激酶上调/下调的蛋白质水平分析。(C类)GA对TNF-α刺激HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。(D类)TNF-α刺激HepG2细胞中IKK和IRS1ser307激酶上调/下调的蛋白质水平分析。(E类)GA对FFA刺激HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。(F类)FFA刺激HepG2细胞中GSK3β和IRS1ser307激酶上调/下调的蛋白质水平分析。误差条表示平均值±S.D(n个= 3) (*第页< 0.05, **第页< 0.01,##
第页< 0.01, ***第页< 0.001,###
第页与激活的胰岛素信号通路组相比<0.001）。
研究表明，TNF-α通过促进IRS-1的丝氨酸磷酸化在肥胖诱导的胰岛素抵抗中发挥重要作用[18,19]. TNF-α通过胰岛素作用的直接和间接机制作用于多个信号节点。在C、 在TNF-α激活的胰岛素信号通路中，葡萄糖消耗呈下降趋势。然而，GA改善了与二甲双胍类似的葡萄糖消耗水平。为了进一步阐明GA的作用，用TNF-α刺激HepG2细胞24小时，然后用5μM和10μM GA处理过夜。如所示D、 模型组IKKα/β和IRS1ser307的磷酸化升高。然而，GA抑制了IKKα/β和IRS1ser307的磷酸化激活。
FFA增加也与肥胖和2型糖尿病相关。较高的FFA水平诱导炎症细胞因子的分泌并降低胰岛素敏感性[20]. 如所示E、 FFA刺激组的葡萄糖消耗减少，但GA以与二甲双胍类似的方式逆转葡萄糖消耗水平(E） ●●●●。为了评估GA调节的IRS1ser307/GSK3β信号传导的分子机制，还研究了IRS1ser304和GSK3α的磷酸化。如所示F、 FFA组显著大于对照组，经GA处理后，IRS1ser307的磷酸化显著降低。相反，FFA组GSK3β的磷酸化相应降低。然而，GA以剂量反应方式逆转了结果。
3.4. GA对GLUT4表达的影响
先前的研究证明，Ras抑制剂5-氟-肉桂酰基硫代水杨酸诱导葡萄糖摄取和mRNA GLUT4表达显著增加[21]. 为了阐明GA是否促进GLUT4蛋白的表达，HepG2细胞与1μM胰岛素孵育36 h，然后用法尼基转移酶（FTase）抑制剂蒂皮法尼（Tip，5μM）或GA（5，10μM）处理过夜。如所示a、 激活的胰岛素信号通路组细胞浆中GLUT4的表达显著降低，导致细胞葡萄糖摄取显著降低。然而，与激活的胰岛素信号通路组相比，Tip（5μM）和GA（5，10μM）组在细胞质中的GLUT4表达显著升高。此外，如免疫荧光染色所示，GA（10μM）和Tip（5μM）均显著改善了HepG2细胞中GLUT4的表达(b） ●●●●。
GA对GLUT4表达的影响。(一)GA显著促进GLUT4蛋白的表达。提取细胞质蛋白后，使用抗GLUT4特异性抗体检测其表达水平。(b条)免疫荧光染色观察到GA显著促进GLUT4的表达，并在倒置荧光显微镜上拍摄照片。误差条表示平均值±S.D(n个= 3) (**第页< 0.01, ***第页< 0.001,###
第页与激活的胰岛素信号通路组相比<0.001）。
3.5. GA对抗炎症和胰岛素反应途径的影响
最近报道了PKC在诱导IRS1ser307磷酸化中的作用[22]. FFA诱导的肝胰岛素抵抗与PKC的膜移位相一致，其联系也得到了证实[23]. PKC抑制剂阻断FFA诱导的JNK和IKKα/β磷酸化，表明JNK及IKK的α/β活化依赖于PKC活性[24]. 在本研究中，FFA激活胰岛素信号通路，导致HepG2细胞中IKKα/β、JNK和p38的磷酸化增加。如所示a、 与GA（10μM）处理相比，JNK、p38和IKKα/β的磷酸化显著降低。此外，GA对PKC激活物PMA刺激的IRS1ser307磷酸化具有强烈的抑制作用。GA还抑制PMA诱导的IKKα/β和JNK磷酸化。结果表明，IKK和JNK的激活依赖于PKC活性，与PKC抑制剂相似(b） ●●●●。上述证据表明，GA抑制的PKC活性降低了IRS1ser307磷酸化，从而改善了HepG2细胞中的胰岛素反应通路，而胰岛素反应通路应由MAPK和NF-κB信号通路调节。
GA对抗炎和胰岛素反应通路的影响。(一)在细胞中检测到ERK1/2、JNK、p38和IKK的总量以及ERK1/2，JNK p38和IK的磷酸化。(b条)GA阻断PMA诱导的（1μM）PKC活性，并抑制PKC诱导的IRS1ser307、IKK、p38和JNK活化的磷酸化。(c（c）,d日)GA对激活的胰岛素信号通路中TNF-α和IL-6水平的影响。为了研究GA对炎性细胞因子的影响，采用ELISA法测定活化胰岛素信号通路中TNF-α和IL-6的水平。HepG2细胞在含有1µM胰岛素的无血清DMEM中培养36小时。激活的胰岛素信号通路中的TNF-α和IL-6水平显著高于对照细胞。用GA（0.1、1和10µM）处理后，培养基中的TNF-α和IL-6水平显著低于激活的胰岛素信号通路。与激活的胰岛素信号通路相比，皮质醇（0.01、0.1和1µM）也能够降低培养液中TNF-α和IL-6的水平。误差条表示平均值±S.D(n个= 3) (*第页< 0.05,##
第页< 0.01, **第页< 0.01, ***第页与激活的胰岛素信号通路组相比<0.001）。
慢性炎症总是伴随着胰岛素抵抗[25]. TNF-α和IL-6是最重要的促炎介质，负责诱导脂肪细胞和外周组织的胰岛素抵抗。抑制TNF-α和IL-6的产生可能是预防胰岛素抵抗和T2DM发病机制的选择之一[26]. 如所示c、 d，结果显示激活的胰岛素信号通路中TNF-α和IL-6水平显著升高。然而，经GA治疗后，TNF-α和IL-6呈剂量依赖性下降。结果表明，GA还通过抑制炎症因子，如IL-6，改善了胰岛素反应途径，这与阳性对照皮质醇相似。
4.讨论
基于细胞的研究表明，胰岛素抵抗通常是通过丝氨酸和苏氨酸残基上IRS的磷酸化来损害胰岛素信号传导[27]. 胰岛素受体的配体对胰岛素受体的激活触发了一系列磷酸化事件。胰岛素与受体α亚单位结合产生构象变化，诱导其催化活化和位于β亚单位胞浆区的几个Tyr残基的自磷酸化，导致受体底物（如IRS和Shc蛋白）的募集和磷酸化[28,29]. IRS1ser307的典型磷酸化被认为介导胰岛素信号通路。在我们的研究中，IRS1ser307的磷酸化被选为关键目标，并使用多种糖尿病因子，如FFA、TNF-α和胰岛素，刺激HepG2细胞并激活胰岛素信号通路。结果表明，GA抑制IRS1ser307的磷酸化激活，上调PI3K/Akt通路中AKTser473和GSK3β的表达，以改善不同胰岛素抵抗条件下的胰岛素敏感性。同时，GA改善了葡萄糖消耗水平，与阳性对照药物二甲双胍相似。
胰岛素受体激活后，一条途径通过胰岛素受体底物（IRS），依赖PI3K/Akt/GSK3β的激活来调节胰岛素的大部分代谢效应，调节葡萄糖转运、糖异生和脂质合成[11]. 另一个受体酪氨酸激酶途径通过将酪氨酸磷酸化IRS或Shc结合到Grb2/Sos、Ras/MAPK途径来调节基因表达、细胞增殖、分化、凋亡、炎症和胰岛素相关的有丝分裂效应[30]. 在几个实验模型中报告了PI3K⁄Akt和Ras/MAPK通路之间的串扰[10]. 例如，菊苣酸，一种在紫锥菊中发现的咖啡酸衍生物，促进葡萄糖胺介导的葡萄糖摄取，并通过激活PI3K-Akt通路和下调Ras/MAPK信号通路而被抑制[31]. RAS/MAPK和PI3K/Akt信号通路之间的相互作用不仅在减轻炎症方面起着重要作用[32]也可以改善胰岛素抵抗。
研究表明，GTPases的小家族（Rab、Ras和Rho）参与胰岛素应答组织中与葡萄糖摄取相关的多种信号转导途径[33]. 先前的研究发现，Ras抑制剂F-FTS可诱导胰岛素敏感性和葡萄糖摄取[21]. 在本研究中，利用GA分子探针通过化学蛋白质组学方法阐明了GA靶向Ras蛋白的可能性，并验证了GA对GTP与Ras结合的分子间相互作用以及降低HepG2细胞中Ras活化的作用。此外，我们观察到GA恢复了高胰岛素诱导的GLUT4易位损伤。因此，我们推测GA通过靶向RAS蛋白来调节GLUT4的表达和转录，以提高葡萄糖摄取。
FFA增加二酰甘油水平，导致PKC激活，从而减少胰岛素介导的IRS和Akt磷酸化以及PI3K激活[34]. IRS/PI3K/Akt/GSK3β信号通路对胰岛素代谢的调节至关重要。如我们的数据所示，GA降低了IRS1ser307的磷酸化水平，并显著促进了GSK3β蛋白的磷酸化。这一结果表明，GA通过激活PI3K/Akt通路逆转胰岛素抵抗。此外，PKC、IKKα/β和JNK与IRS蛋白磷酸化和诱导胰岛素抵抗有关。对于PKC家族成员，由PMA激活[35]，其活性由MAPK途径的成员介导[36]. 类toll受体的配体FFA激活PKC介导的MAPK通路[37]. 增加的FFA水平也会增加IKK和JNK的活性，导致IRS1ser307的丝氨酸磷酸化并阻断IRS酪氨酸磷酸化[38]. 活化的PKC还可以增强促炎介质的产生，从而增加导致肥胖诱导的胰岛素抵抗的炎症[39]. 我们的结果表明，GA对PKC特异性激活剂PMA刺激的HepG2细胞IRS1ser307磷酸化具有强烈的抑制作用，并诱导IKKα/β和JNK的磷酸化。此外，GA剂量依赖性地抑制激活的胰岛素信号通路中TNF-α和IL-6的过度生成。这些结果表明，以PKC蛋白为靶点的GA通过抑制MAPK和NF-κB信号通路改善了胰岛素反应通路。
总之，本研究表明，GA通过激活PI3K/Akt信号通路和抑制Ras/MAPK，调节GLUT4表达、糖原合成和减轻炎症，改变精细平衡以改善胰岛素反应通路，从而作用于Ras和PKC靶点。虽然天然产物对糖尿病的防治有很多作用，但其降血糖机制的研究仍需进一步深入。同时，副作用和毒性仍然是一个需要考虑的问题。
作者贡献
概念化、Y.H.和G.B。；数据管理，Y.Z.、M.Z.、Z.W.和X.H。；形式分析，Y.Z.、M.Z.和X.H。；资金收购，G.B。；调查、Y.Z.和S.Y。；方法论，Y.Z。；项目管理、Y.Z.和S.Y。；监督，G.B。；验证、Y.Z.和Y.H。；写作——原稿，Y.Z。；写作-审查和编辑，G.B。
基金
本研究由国家自然科学基金资助（81430095，81673616，81473403）；国家自然科学基金国际合作与交流项目（81761168039）。
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