跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
国家通讯社。2019; 10: 952.
2019年3月12日在线发布。 数字对象标识：10.1038/s41467-019-08750-9
预防性维修识别码：PMC6414607型
PMID：30862827

无创性亚器官超声刺激靶向神经调节

维多利亚·科特罗,1 英凡,1 茶渣,2 亚当·克雷塞尔,2 伊莉安娜·汉库,1 保罗·菲兹杰拉德,1 柯克·华莱士,1 Sireesha Kaanumalle公司,1 约翰·格拉夫,1 韦恩·里格比,1 子仁高,1 珍妮特·罗伯茨,1 奇特雷斯·布珊,1 苏雷什·乔尔,1 托马斯·科尔曼,2 斯塔夫罗斯·扎诺斯,2 凯文·特蕾西,2 杰弗里·阿什,1 Sangeeta S.Chavan公司,2和克里斯托弗·普利奥通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

非侵入性调节外周器官神经信号的工具将促进神经及其对体内平衡和疾病的影响的研究。在此，我们展示了一种使用超声（U/S）调节器官内特定信号通路的非侵入性方法。U/S首先应用于脾脏以调节胆碱能抗炎途径（CAP），US刺激可将细胞因子对内毒素的反应降低到与植入迷走神经刺激（VNS）相同的水平。接下来，肝脏U/S刺激被证明可以调节调节血糖的途径，并且在抑制内毒素暴露的高血糖效应方面与VNS一样有效。只有当靶向已知含有葡萄糖感觉神经元的特定亚器官部位时，才能发现对肝脏U/S的这种反应，分子（即神经递质浓度和cFOS表达）和神经影像学结果均表明US诱导的信号传导至代谢相关的下丘脑亚核团。这些数据表明，器官内的U/S刺激为位置选择性神经调节提供了一种新的方法，以调节特定的生理功能。

主题术语：超声波、周围神经系统、炎症

刺激外周神经活动可用于治疗代谢性和炎症性疾病，但目前的方法需要植入装置。在这里，作者提出了一种非侵入性方法，并表明超声介导的刺激可以针对临床前模型中的特定亚器官部位，并改变代谢和炎症神经通路的反应。

介绍

每个器官都含有调节器官功能的神经。新的医疗设备正在开发中，可以调节这些神经上的信号来治疗疾病1,2（例如，炎症三、高血压4、糖尿病5、肥胖6和胃肠道疾病7,8). 然而，使用永久植入电极的神经刺激策略三,9,10，经皮电磁场11,12或采用脑刺激技术13–16仅限于刺激可通过植入装置进入的大神经（图1a个)或靠近皮肤表面的神经。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2019_8750_Fig1_HTML.jpg

基于植入物的迷走神经刺激（VNS）与精密超声（U/S）神经调节。一迷走神经内的神经元、典型的神经支配器官以及用于VNS设备的常见颈部位置示意图。刺激颈迷走神经可刺激靶向和非靶向传出和传入通路1–10.微型刺激器和先进的电极设计的临床应用，可以植入更靠近目标器官的部位（用于精确刺激仅进入该器官的轴突），这是一项具有挑战性的工作，目前仍难以实现9,17,18.b条基于精确器官的神经调节示意图，其中已知轴突群体的神经支配点被靶向以使用聚焦脉冲U/S进行刺激。本文研究的靶点包括脾脏内的神经支配点和肝脏内的感觉末梢

外周神经系统（PNS）的解剖结构面临着困难的挑战。在外周神经内，单个轴突被紧紧地捆绑在一起（束），并包裹在保护组织内。这使得很难选择性地刺激终止于特定器官的轴突亚群，并独特地调节该器官内通信细胞的功能。研究人员试图开发越来越先进的电极设计9,17或微型刺激器18植入目标附近较小的神经。然而，精确的外周神经刺激的临床实施仍然难以捉摸。例如，迷走神经刺激（VNS）的研究依赖于颈部植入物（图1a个)激活传出的广泛混合物1,三,5–7,19–22和/或传入5,6,21–23神经通路。尽管有前景的VNS试验，但低精度刺激方案不允许临床观察与特定神经靶点直接相关，而无需对其他（非靶点）神经通路进行非特异性刺激三,6,21,22需要新的神经刺激方法来非侵入性刺激特定靶点，并将特定组织的神经活动与功能联系起来，以实现广泛的临床转化。

先前尝试仅利用U/S直接刺激外周神经，将U/S能量集中在植入电极的同一条大神经（器官外）上，这种策略产生了相互矛盾的结果。聚焦于体外神经的超声波已被证明在有限的条件下刺激神经（即激发动作电位）23–25或可能对神经和/或周围组织造成损伤的功率24,26同时，体内研究也未能引发神经激活23，或通过神经肌肉通路间接测量神经激活的方法（即测量U/S诱导的肌电信号或肌肉运动）27,28相比之下，一些报告已经证明大脑组织中的末端轴突或神经末梢被成功激活29和视网膜30最近，Okusa组显示胆碱能抗炎途径（CAP）激活1,三,6,10使用脾超声成像协议；利用超声成像扫描成功预防急性肾损伤（AKI）小鼠模型的肾缺血再灌注损伤31该小组通过一系列对照实验将超声效应与CAP激活联系起来，包括脾切除术、CD4（+）T细胞过继转移研究、α7烟碱乙酰胆碱受体阻断和基因敲除31.

其中，U/S能量直接集中在神经支配的特定解剖目标上（图1亿)在脾脏和肝脏内（无需扫描超声换能器）。如上所述，脾脏内的神经支配被认为通过CAP影响全身炎症6,19,20肝脏中的神经被认为与大脑沟通，并在葡萄糖调节系统内提供营养感应的关键组成部分32在此，我们证明这两种途径都可以通过靶向U/S进行调节，并且无创U/S技术可以在与传统侵袭性VNS相当的水平上减轻内毒素诱导的细胞因子生成和高血糖。此外，与颈部VNS（广泛刺激多种迷走神经通路）不同，精确的超声神经调节可以单独调节脾脏（抗炎）和肝脏（代谢）通路。脾脏刺激数据表明，对去甲肾上腺素有明确的超声“剂量反应”，具有内毒素模型中细胞因子减少所需的不同功率水平，以及与潜在临床应用相称的有效功率范围。脾脏和肝脏刺激数据均通过U/S诱导的神经调节的直接测量（即脾脏实验中的神经递质浓度，以及肝脏实验中的cFOS和DfMRI数据）呈现，以及对下游信号通路影响的间接测量（即，几个重要/相关细胞内信号通路的激酶活性）。最后，对脾通路中的几个信号成分进行了化学/机械阻断和基因敲除实验，并报告了这些敲除对超声诱导CAP激活的影响的数据。这些结果，再加上Zachs等人的配套论文（证明在炎症性关节炎临床前模型中使用脾脏U/S刺激来降低疾病严重程度），提供迄今为止最全面的报告，说明精密超声刺激替代植入式设备翻译外周神经调节疗法的潜力1,2.

结果

靶向性亚器官超声神经调节

在脾脏刺激实验中，监测参与CAP的每种细胞类型的输出（使用LPS诱导的急性炎症啮齿动物模型，在不同的U/S刺激条件下）（图2a、b; 有关U/S刺激和LPS模型的详细信息，请参见方法6,19–22). CAP（图1亿)包括三种主要的细胞类型：从脾神经节投射的末端轴突终末、中间T细胞和全身释放细胞因子的巨噬细胞。对该通路的电刺激进行了深入研究；神经调节影响细胞因子的产生，并可能对几种慢性炎症疾病提供治疗益处三,7.图2亿显示了用于非侵入性靶向U/S刺激的示例U/S图像（参见方法和补充图1–5有关图像引导的详细信息）。与之前的超声刺激示例不同31超声刺激不是扫过器官或聚焦于器官外的大神经，而是针对器官内神经支配的特定位置（参见补充图5有关器官内估计刺激区域的详细信息）。我们通过测量CAP相关神经递质和细胞因子（包括去甲肾上腺素（NE）、乙酰胆碱（ACh）和肿瘤坏死因子（TNF）的脾脏浓度来评估CAP对靶向US刺激的反应；参见ELISA和HPLC程序的方法；参见补充图6用于LPS-幼稚动物的数据）。答1.1 使用U/S耦合凝胶将MHz U/S传感器直接聚焦于脾靶。图2c–f显示了在对照啮齿动物（那些接受过LPS而不是U/S刺激的啮齿动物）和U/S治疗啮齿动物中测量到的CAP反应。脾脏NE水平平均140 幼年动物的nmol/L，而LPS对照组的NE水平下降到接近零，表明在LPS诱导的炎症过程中CAP信号被抑制。U/S刺激减弱了LPS对幼稚动物所测水平的反应（图2厘米). 与CAP信号传递过程一致，U/S刺激动物的NE增加与脾脏ACh增加相关，在0.83 MPa U/S压力下，ACh平均浓度几乎是假动物的三倍（图二维). 此外，两个脾脏（图第二版)和循环（图第2页)与假动物相比，TNF水平显著降低。治疗反应取决于U/S压力，剂量-反应曲线显示最有效的压力参数范围为0.25至0.83 MPa（Zachs等人在我们的同伴论文中证实的参数）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2019_8750_Fig2_HTML.jpg

胆碱能抗炎途径（CAP）的脾脏U/S神经调节。一LPS诱导炎症模型中U/S神经调节的时间轴（见方法和补充图1–6详细信息；刺激参数为1.1 兆赫，136.36 µs脉冲长度和0.5 ms脉冲重复周期）。b条用于定位U/S刺激的脾脏U/S图像示例（白色箭头表示脾脏轮廓；绿色箭头表示U/S激励的目标点）。c（c）–e（电子）CAP信号分子（包括去甲肾上腺素）的脾脏浓度(c（c）)，乙酰胆碱(d日)和TNF(e（电子）)显示了幼稚动物、假对照组（LPS，-U/S）和U/S刺激（0.03–1.72 MPa）。（f）相同条件下TNF的全血浓度(e（电子）). 星号使用双面标记统计显著性t吨-测试与仅LPS控制（带有第页-价值阈值*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).n个 = 除所有LPS外，该图中的所有实验均为5 − （U/S）控制n个 = 7

还研究了U/S刺激对CAP相关的细胞内外信号通路的更广泛影响，以及U/S效应的动力学。除TNF外，U/S刺激还显著降低了脾脏白细胞介素-1α（IL-1α）水平（图3a年). U/S介导的对LPS暴露的最大反应发生在1-2 处理后h（图第3页)显示出与先前基于植入物的VNS研究类似的动力学6,19–21为了进一步描述这种效应，我们测量了特定细胞内激酶的U/S激活（图3立方厘米)与LPS相关的-33，盖-34，或TNF-α介导35发送信号。这些数据表明，U/S强烈增强了一些激酶（例如p38和p70S6K）的激活，而一些激酶（如p38）的U/S压力依赖性反应与之前观察到的神经递质和细胞因子浓度的U/S-压力依赖性大致相关（图2c–e段). 最后，在注射LPS之前应用脾脏U/S显示出持续的抑制作用（图三维)也与之前的侵袭性VNS研究一致6,19–21.图三维表明这种保护作用在治疗后持续良好，单次U/S治疗可使TNF对内毒素的反应降低48 U/S刺激后h。为了证实这一点，Zachs等人（使用血清转移性关节炎小鼠模型）的同伴论文独立地表明，无创性脾U/S刺激可以减轻关节炎的严重程度，并且这种超声特异性效应（使用相同的最佳超声频率和类似的刺激压力）在诱导和疾病表现之前或之后给药时明显。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2019_8750_Fig3_HTML.jpg

脾脏U/S神经调节的持久效应。一从与图中相同的样品中测量的脾脏IL-1α浓度2c–e段.n个 = 5适用于所有实验条件，但LPS–（U/S）对照组除外n个 = 7b条研究时间表和数据设计用于测量响应时间为1-3后脾脏TNF的浓度 h（即处理后收获样品的时间）。n个 = 每个实验条件下为4。c（c）具有或不具有U/S刺激压力的活化/磷酸化激酶的标准化浓度（与LPS对照相比）从0.03到1.72 兆帕。n个 = 每个实验条件下为4。d日延迟时间从0.5到48后，保护性（LPS前）U/S治疗后脾脏TNF的浓度 注射LPS前h。n个 = 5.星号使用双面标记统计显著性t吨-试验与仅LPS对照（第页-价值阈值*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001). 此图中的所有实验均使用与图中相同的US设置进行2(0.83 兆帕）

为了进一步证实CAP在调节脾脏U/S刺激抑制效应中的作用，我们在其他敲除和失神经模型中进行了测试（图4)包括裸鼠（缺乏功能性T细胞；图4a类)，CD4 ChAT（胆碱乙酰转移酶）敲除小鼠（C基因切除小时CD4+T细胞中的At图4a类)，α7nACh受体（图4a类)敲除小鼠和利血平处理小鼠（抑制儿茶酚胺生成；图4b个). 方法部分包含用于创建每个淘汰模型的方法的描述，以及基于利血平的儿茶酚胺储备耗尽协议。在野生型C57black/6小鼠中，脾脏U/S刺激可显著抑制内毒素诱导的全身TNF水平（图4a类)与内毒素血症大鼠的观察结果相似（图2). 为了研究T细胞的作用，我们对裸鼠进行了脾脏U/S刺激。脾脏U/S刺激未能在裸鼠中诱导LPS诱导的TNF抑制，这表明U/S介导的抑制需要功能性T细胞（图4a类). 接下来，为了确定U/S介导的抑制是否需要产生乙酰胆碱的T细胞，我们使用Cre-loxP公司小鼠重组选择性消融C小时CD4+T细胞中的At。脾脏U/S刺激CD4 ChAT与对照组相比，KO小鼠没有显著改变TNF水平，这表明U/S刺激需要产生乙酰胆碱的T细胞来介导TNF抑制（图4a类). 巨噬细胞是内毒素血症期间TNF生成的主要来源α7nAChR巨噬细胞表达在调节胆碱能抗炎信号中起关键作用36因此，我们在缺乏脾脏刺激的动物中测试了脾脏U/S刺激的效果α7nAChR表达式。如图所示4a类在α7nAChR KO小鼠内毒素血症期间，U/S刺激没有抑制TNF水平。在内毒素血症模型中，脾脏U/S刺激导致脾脏去甲肾上腺素水平显著增加（图2亿). 为了进一步评估儿茶酚胺在该途径中的作用，我们对先前通过利血平治疗而耗尽儿茶酚胺储备的内毒素血症小鼠进行了脾脏U/S刺激。脾脏U/S刺激减弱了对照动物的全身TNF水平，但利血平治疗的动物没有（图4b个). 总之，这些发现表明，脾脏U/S刺激通过CAP减弱内毒素血症期间TNF的生成，并进一步证明了神经调节机制与直接超声对脾脏免疫细胞的影响相比。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2019_8750_Fig4_HTML.jpg

脾脏U/S刺激通过CAP抑制内毒素血症期间的全身TNF水平。一假对照组（LPS，-U/S）和U/S刺激小鼠（0.83）的脾脏TNF浓度显示 MPa超声设置）用于C57black/6小鼠、Nude小鼠，CD4 ChAT敲除小鼠和α7nAChR敲除小鼠。b条假对照组（LPS，-U/S）和U/S刺激小鼠（0.83）的血清TNF浓度显示 MPa）盐水注射对照组和利血平治疗/失神经小鼠的超声设置（详细信息见方法）。此图中的所有实验均使用与图中相同的U/S设置进行2和​和3三（0.83 兆帕）

然后将脾脏U/S神经调节的效果与基于标准植入物的VNS进行比较（有关VNS的详细信息，请参阅方法）。图5a级显示有创性颈部VNS和无创性脾U/S刺激对TNF的影响几乎相等（见U/S（左）刺激和VNS植入物刺激（右）条，不添加激酶抑制剂（-PP2、-LY和-PD））。此外，图5亿表明脾内注射α-银环蛇毒素（BTX，一种已知的CAP信号中枢α7nACh受体拮抗剂19–22)抑制U/S刺激对TNF-α浓度的影响三,19–22，U/S的最佳CAP调制需要脾α7nAChR信号）。与CAP模型一致（图1亿)，NE浓度不受BTX的影响（即BTX通过α7nAChR途径阻断NE升高的效应，而不是通过改变神经递质释放本身）。迷走神经切断术也通过U/S抑制CAP调制（图5亿)，将U/S刺激对TNF浓度的影响抑制到与BTX相同的水平。然而，在LPS实验期间，迷走神经切断术未能抑制U/S对脾脏内NE浓度的影响，这表明颈部迷走神经切除术可能不会立即影响局部脾组织（迷走神经切开的下游）对超声刺激的反应能力。这一数据表明，U/S诱导的TNF抑制减弱，而U/S后NE浓度没有改变，这也可以通过最近对迷走神经抗炎途径的研究来解释，该研究表明关键α7nACh受体的其他位置22最后，激酶抑制剂PP2（4-氨基-5-（4-氯苯基）-7-（二甲基乙基）吡唑并[3,4-d]嘧啶，对Src激酶有部分选择性）和LY294002（PI3-激酶选择性）被证明抑制了U/S效应，而PD98059（MEK1-和MEK2-选择性MAPK抑制剂）则没有效果（图4a类). 这些结果证实了图中的结果3立方厘米其中U/S刺激改变了CAP内的激酶激活34和TNF35相关的PI3（即Akt、P70S6K）、c-Src和p38-MAPK通路，但不涉及直接细菌抗原反应的激酶（即GSK3B）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2019_8750_Fig5_HTML.jpg

脾U/S刺激与CAP传统颈部VNS的比较。一美国刺激的脾脏TNF相对浓度如图所示（左侧；刺激为0.83 MPa）与基于植入物的VNS（详见方法）治疗动物（浓度显示为相对于LPS治疗假刺激对照的百分比变化）。每个图表左侧的第一个栏显示了在不添加任何阻滞剂或抑制剂的情况下，超声波与VNS对减轻LPS诱导的炎症的作用。其余条显示了预注射抑制剂PP2（4-氨基-5-（4-氯苯基）-7-（二甲基乙基）吡唑并[3,4-d]嘧啶，对Src激酶具有部分选择性）、LY294002（PI3-激酶选择性）和PD98059（MEK1-和MEK2-选择性MAPK抑制剂）的效果。n个 = 每个实验条件4个。b条数据显示，在US刺激后，α-银环蛇毒素（BTX）或外科（颈部）迷走神经切断术对脾脏（左）去甲肾上腺素（NE）和（右）TNF浓度的影响。n个 = 每个实验条件下为4。c（c）比较VNS（不同强度和频率）和脾US刺激（0.83）的效果的数据 MPa）（见方法）。d日数据显示，脾脏和肝脏U/S刺激的调节TNF反应具有特异性，但不同脾脏刺激位置（即脾门、上极和下极）的TNF反应相似。n个 = 每个实验条件下为3。e（电子）证实VNS对LPS诱导的高血糖的减弱有副作用，并且在使用脾脏U/S刺激时没有这种副作用的数据。在5、15、30和60次时，显示相对血糖浓度与注射前浓度的比较 非刺激对照组（蓝色圆圈）、脾脏U/S刺激（紫色三角形）或颈部VNS（浅蓝色方形）为min。n个 = 每个实验条件下12个。该图中的所有实验均使用与图中相同的U/S参数进行三和​和44

然后通过测量侵袭性VNS的几种已知副作用来研究聚焦U/S刺激的生理特异性。图5厘米显示了由颈部VNS或脾脏U/S神经调节引起的心率变化（详见心率测量方法）。在2 V和5 V VNS强度下，心率显著降低。然而，局部脾U/S神经调节对心率无影响。刺激非靶点（即肝脏）不会调节LPS诱导的TNF反应；然而，在脾脏内几个不同部位的U/S刺激对TNF反应有类似的调节作用（图5天). 有趣的是，图第五版显示脾脏U/S刺激对血糖浓度没有影响，而VNS实验显示了先前观察到的减轻LPS诱导的高血糖的副作用。假设CAP靶向VNS的这种代谢副作用6可能是由于第二条（非CAP）迷走神经通路的离靶VNS。

精确刺激肝脏的感觉部位

VNS已被证明可降低高血糖5,6为了研究这是否与肝脏部位的神经调节有关，将VNS与我们应用于肝脏的精确U/S刺激技术进行了比较。图第6页显示了U/S图像引导，可以将U/S刺激定位在肝脏的肝门区，肝门区包含已知的葡萄糖敏感神经元，这些神经元向下丘脑内的代谢控制中心发出信号并进行调节37我们发现肝脏U/S刺激对LPS诱导的高血糖有保护作用，如图6b个表明U/S刺激将血糖水平的升高限制在餐后浓度范围内。此外，这种效应在解剖学上是特定的。图6b个显示将刺激物放置在肝右叶或左叶会降低U/S刺激的效果。此外，与葡萄糖代谢相关的局部信号分子的肝脏浓度表明，U/S刺激在肝脏内没有显示出直接的变化，表明肝糖酵解或糖原酵解过程受到直接调节（图第6页c，灰色条）。相反，发现U/S刺激包含肝门区的感觉神经元导致下丘脑NPY浓度显著降低，下丘脑胰岛素受体底物（IRS-1）和蛋白激酶B（pAkt）激活增加（图第6页c，蓝色条）。IRS和pAkt磷酸化的增加表明下丘脑中的胰岛素信号增加，这能够驱动NPY浓度的降低。这些结果与先前关于脂多糖诱导胰岛素介导的IRS1-P13信号调节异常的报道一致38有趣的是，这些结果还表明，通过中枢神经系统的信号改变可能参与了慢性炎症（即代谢性内毒素血症）在胰岛素抵抗发病机制中的作用39,40.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2019_8750_Fig6_HTML.jpg

影响葡萄糖调节的途径的肝脏U/S刺激。一肝脏的二维超声图像用于将超声刺激聚焦到目标部位（绿色箭头；白色箭头-肝脏轮廓）。b条数据显示U/S刺激肝脏对LPS诱导的高血糖的影响。与注射前浓度相比，相对血糖浓度显示在5、15、30和60倍 min.数据显示，与单独LPS（蓝色圆圈）或单纯/无LPS刺激（浅蓝色偶极子）样本相比，U/S刺激肝门（红色方形）后LPS诱导的高血糖得到逆转，但远端叶（紫色三角形）没有逆转c（c）肝脏和下丘脑代谢相关分子的相对浓度与无U/S相比。下丘脑中的去甲肾上腺素（NE）、蛋白激酶B（pAkt）、胰岛素受体底物1（IRS-1）和神经肽Y（NPY）对U/S刺激有显著反应。星号使用双侧标记统计显著性t吨-测试与仅LPS控制（带有第页-价值阈值*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).n个 = 每个实验条件下12个。该图中的所有实验均使用与图中相同的U/S参数进行三–5

观察到大脑中的这种反应后，我们试图验证传入通路中的神经元受到肝脏U/S刺激的调节（补充图11包含与葡萄糖调节和与下丘脑相互作用的内稳态有关的已知传入和传出神经通路的描述）。U/S诱导的神经调节首先通过测量已知调节葡萄糖稳态的下丘脑和脑干亚核内即时早期基因c-Fos的表达来量化（图7a、c和补充图12）37,41与对照组相比，c-Fos阳性的数量有显著变化（c-Fos+；图第6页)室旁核（PVN）、背内侧核（DMN）、腹内侧核（VMN）、弓状核（ARC）和下丘脑外侧核（LH）内的细胞，表明U/S诱导LPS诱导的糖调节神经信号的调节。这些数据证实了先前的发现，即超声波刺激正在调节下丘脑胰岛素敏感性（图第6页c)导致神经活动发生变化，已知这些变化会改变PVN的信号（以及传出或外周代谢调节）37–39,42,43此外，下丘脑c-Fos表达的改变伴随着孤束核内c-Fos的表达增加（NTS；补充图12)，表明U/S通过传入途径的信号传导进行调节（参见免疫组织化学方法）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2019_8750_Fig7_HTML.jpg

与肝脏U/S刺激反应相关的神经通路的组织化学和DfMRI分析。一cFOS免疫组织化学图像显示（顶部）未刺激对照组和（底部）U/S刺激组动物中激活的神经元数量。在室旁核（黄色；PVN）、背内侧核（绿色；DMN）、腹内侧核（红色；VMN）、弓状核（深蓝色；ARC）和下丘脑外侧核（紫色；LH）上分割图像。比例尺 = 300微米。b条激活图和T1-SPGR容积之间的MRI叠加示例（顶部；详见方法）和T1-SGR容积上的脑图谱叠加示例（底部；详见方法，补充图13和14、和补充表2更多详细信息）。顶部图像中的蓝色表示在超声检查后ADC发生显著变化的区域。底部图像中的每种颜色表示地图集中解剖上不同的大脑区域；显示ADC降低的主要区域（上图；红色箭头）与下图中的左侧（棕色）和右侧（浅绿色）PVN对齐（红色箭头）。c（c）显示美国刺激动物中cFos表达细胞数量变化百分比的数据(n个 = 8） 与假对照组相比(n个 = 6） 在每个分段的下丘脑区域（PVN、DMN、VMN、ARC和LH）(一)代表一组假配对动物与受刺激配对动物。d日 T型-治疗前和治疗后ADC图之间PVN ROI内相应像素比较的测试值（详见方法）显示，在U/S刺激后测试的6只动物的ADC值（与对照组相比）增加(b条)代表一个样本动物的结果。该图中的所有实验都是使用与图1和图2相同的U/S参数进行的三–6除了DfMRI实验需要与MR兼容的超声换能器外。兼容的超声波换能器的声波频率为1.47 兆赫。方框内的带显示第二个四分位数，而胡须表示所有数据的最小值和最大值

为了进一步支持先前的研究结果，我们比较了肝脏U/S刺激前后下丘脑亚核团扩散加权功能磁共振成像（DfMRI）图像的表观扩散系数（ADC）。DfMRI44–46是一种仍在开发中的技术，最近被证明对外部神经调节剂驱动的神经活动变化敏感47（见方法，补充图13和14、和补充表2有关DfMRI详细信息）。作为对U/S刺激的响应，PVN内的ADC发生了显著变化，证实了化学物质（POMC，NPY）和c-Fos表达数据，这表明U/S对LPS激活的与下丘脑沟通的通路进行了调节。图7亿显示了一个示例t吨-显示U/S介导的ADC变化的测试图（上图）（表明超声调制的神经活动发生变化44–47). 图7天总结了所有实验中PVN内的ADC变化（包括图中所示动物的数据）。​图7b）。7亿). DfMRI（尽管是新开发的47)在检查由外部超声神经调节驱动的神经活动的变化方面是有用的。并且，当综合DfMRI、cFos和下丘脑神经化学结果时，提供了一组数据，这些数据与超声激活一条途径相互一致，该途径通过NPY系统调节LPS诱导的能量代谢效应及其对传出PVN信号的影响42,43.

讨论

在这项工作中，我们证明了通过对神经支配的靶点进行亚器官U/S刺激进行无创性神经调节。我们的技术使用聚焦超声定位特定突触连接和生理功能的神经支配点和区域。这种方法利用神经系统的自然层次结构和组织，通过无创刺激技术实现精确的神经调节。用同样的技术实现了对两个完全不同的器官和不同的生理通路（脾脏中的CAP和肝脏中的代谢感觉神经元/细胞）的超声调制。这为应用该方法调节其他外周信号通路打开了潜力，为绘制PNS与健康和疾病中生理器官功能之间的结构-功能关系提供了一种新的U/S工具。

关于脾CAP途径，最近的一项研究表明，通过基于植入物的VNS增强CAP信号可以抑制人类细胞因子（即TNF、IL-1β和IL-6）的产生和循环三和之前的临床前模型一样1,2,6,7,10,21,22此外，VNS在长达84天的全血检测中显著抑制了TNF的生成，并在类风湿关节炎患者的初步研究中积极影响疾病严重程度三作为第一项同类研究，它显示了在目前使用药物治疗的疾病中使用神经调节疗法的潜力。然而，需要进行更大规模的研究，以进一步分析使用植入式神经刺激器替代药物治疗的风险与效益。

另一个有趣的选择是，Zachs等人在我们的同伴论文中的研究人员表明，脾脏超声刺激可以有效降低炎症性关节炎小鼠模型的疾病严重程度（使用我们数据证实的所选U/S刺激参数和强度）。一个单独的研究小组31最近还发表了一种成像或换能器扫描方法的使用，该方法将超声应用于脾脏以激活CAP并改变疾病（即在AKI小鼠模型中预防肾脏缺血再灌注损伤）。在此，我们证明了精密超声应用（无需扫描换能器或超声能量）也足以激活CAP。此外，利血平/儿茶酚胺耗竭实验的结果表明，这种效应依赖于超声与神经系统（或接口细胞）的相互作用，为该技术作为非侵入性神经调节方法的使用提供了进一步证据。这是第一篇关于精确或局部神经激活（使用聚焦和图像靶向超声束）的报告，它证明了超声作为植入式神经调节的低侵袭性替代物的潜力，并为生物电子药物的临床转化开辟了新途径1,2.

为了证明这一潜力，我们的团队首次将精确/图像靶向超声刺激应用于非CAP神经靶点（肝脏靶点，先前假设为葡萄糖感觉神经元的藏身地37,41). 我们的结果证实了以前的研究，即利用葡萄糖钳方法控制循环葡萄糖水平的浓度和/或波动，从而从外周器官中的葡萄糖/营养感应神经元发出信号37,43这些早期钳夹技术（需要从全身血液中分离局部血液循环，如门脉血）非常困难，因此限制了试图确定外周感觉神经元在代谢稳态中具体作用的研究数量。相比之下，本文所述的技术代表了一种通过实验调节外周感觉输出的新方法，并且可以实现对外周感觉和信号在健康和疾病中的贡献的新一波研究。

需要继续努力，以进一步探索精确超声神经调节的潜力。补充图5提供了示意图，显示了在此刺激特定解剖目标时获得的精度水平。进行肝脏和肝脏刺激实验时，部分刺激超声束略微超出目标器官（约2 脾刺激器官外mm，<0.5 mm用于肝脏刺激）。在未来的实验中可以利用新的超声换能器技术来提高刺激精度48–50然而，这里的数据代表了第一份报告，其中目标超声工具能够刺激单个器官内的多个点（即肝门区相对于右或左叶的刺激，图6)这项初步实验已经观察到基于刺激位置的差异效应。本文的数据还代表了首次使用神经调节技术分别减弱LPS诱导的细胞因子对高血糖的影响，显示出超出颈部VNS的特异性（图5). 这些初步结果表明，对超声用于外周神经调节的进一步投资和研究是合理的，需要超声设备工程师和神经科学家加强合作。

本文的结果也为围绕超声在神经调节实验中的确切机制的持续争论增添了数据23–30,51.补充表1提供了将本文中使用的超声参数与用于评估超声的基于加热（TI）或空化（MI）的生物效应的可能性的标准临床测量（MI（机械指数）和TI（热指数））进行比较的附加细节52上述实验中使用的超声波参数仍低于将组织加热到目前已知的激活热敏离子通道温度的预期参数16,53或产生气穴，这与之前的报告一致，这些报告表明大脑或神经组织（或周围/支持细胞和组织结构）直接机械激活29本文显示的利血平/儿茶酚胺耗竭实验也表明了外周器官超声神经调节的神经介导机制；然而，上述结果并没有明确识别与超声能量转导相关的细胞或分子成分。在器官或类器官体外模型中超声刺激的进一步研究（直接显微镜下观察）有必要阐明超声刺激的特定分子转导途径。

未来的诊所翻译也将面临挑战。如本手稿所示，提供神经调节作用的超声参数在目前临床使用的范围内（补充表1). 然而，人体器官大于本文研究的临床前器官靶点，以及类似的临床“剂量”研究（如上文临床前模型数据和补充图中所示8–10)需要确定精确超声刺激在人体解剖中的效果。此外，人类患者群体存在异质性，包括体重指数、骨骼和骨骼大小和形状以及神经/器官位置。临床上用于测试基于超声的神经调节的工具需要复杂度来调整刺激目标和参数，以便每个患者都能接受已知和受控的超声“剂量”。我们的团队目前正在设计和构建所需的工具，以在其他临床前疾病模型（包括脓毒症、肥胖和糖尿病模型）和临床环境中实现精确的神经调节。这些正在进行的研究将进一步测试非侵入性U/S刺激对各种解剖和器官靶点的广泛应用，并确定这些工具是否适用于广泛的健康障碍。

方法

聚焦超声（FUS）探头的设置和表征

聚焦超声（FUS）系统的框图如补充图所示1系统由1.1组成 MHz、高强度聚焦超声（HIFU）换能器（Sonic Concepts H106）、匹配网络（Sonic Conceptes）、射频功率放大器（ENI 350L）和函数发生器（Agilent 33120A）。直径为70-mm的HIFU传感器具有曲率半径为65-mm的球面。它的中心有一个直径为20毫米的孔，可以插入成像传感器。传感器的焦距为65 mm。数值模拟压力剖面在半振幅为1.8时具有全宽 横向mm和12 在深度方向上为mm。HIFU传感器通过充满脱气水的6厘米厚塑料锥与动物进行声学耦合。

函数发生器产生脉冲正弦波形，如补充图所示2该脉冲正弦波形由射频功率放大器放大，并发送至与HIFU传感器相连的阻抗匹配网络。在大多数动物实验中，脉冲中心频率为1.1 MHz，脉冲重复周期为0.5 ms（对应于2000的脉冲重复频率 赫兹）；脉冲幅度和脉冲长度不同。补充表1列出了实验中使用的脉冲幅度和长度的组合；第三列列出了由脉冲电压振幅导出的焦点处的峰值超声压力。

使用针式水听器（ONDA HNA-0400）在脱气水中对HIFU传感器进行电压-压力校准。HIFU传感器由100周正弦电压波形驱动。为了定位峰值压力的位置，在0.1英寸的标称换能器焦点附近扫描水听器 在横向平面上为mm台阶，在深度方向上为0.2台阶。补充图三显示了在焦点深度通过平面的扫描。驱动电压低于60 五、 水的非线性很小，即最大负压和最大正压几乎相等，压力随驱动电压线性变化。

超声靶向治疗器官特异性神经调节

在开始神经调节之前，使用Vivid E9超声系统（GE Healthcare）或11L探头（GE Hearthcare”）进行超声扫描。补充图4显示了大鼠脾脏的图像（补充图4A级)和大鼠肝脏（补充图4B类). 基于该初始图像，HIFU传感器被定位在目标区域。还使用一个较小的成像探头（3S，GE Healthcare）进行了另一次超声扫描，该探头位于HIFU换能器的开口处（补充图4摄氏度). 3S探头的成像光束与U/S光束对齐。因此，可以使用目标器官的图像（在Vivid E9上显示）确认U/S波束瞄准了感兴趣的区域。识别出感兴趣的器官后，在动物皮肤上标记换能器位置，并将HIFU换能器放置在标记区域，利用超声波距离调整适当器官靶的深度。

动物模型和超声刺激方案

成年雄性Sprague-Dawley大鼠8-12周龄（250-300 克；Charles River Laboratories）被安置在25岁 在进行实验之前，以最大限度地减少因压力反应而产生的潜在混淆措施。水和常规啮齿动物食物可以随意使用。实验按照GE全球研究机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

内毒素（脂多糖（LPS）来自大肠杆菌，0111:B4；Sigma–Aldrich）用于在幼年成年Sprague-Dawley大鼠中产生显著的炎症和代谢功能障碍状态（如高血糖和胰岛素抵抗）。给动物注射LPS（10 mg/kg），相当于LD75的近似剂量，通过腹腔注射（IP）导致TNF、循环葡萄糖和胰岛素浓度显著升高；这些浓度在4年内达到峰值 h，但与对照组相比保持升高，最多持续8小时 注射后h。LPS给药后，60岁时采集脾脏、肝脏、下丘脑、海马和血液样本 大多数研究为min；在1、2和3 h用于动力学研究（图第二版)以及0.5、1、2、4、8、24和48 h用于持续时间研究（图2克，小时). 脾脏和肝脏样本的制备如下所述。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）分析样品中细胞因子（Bio-Plex-Pro；Bio-Rad）、肿瘤坏死因子α（TNF）（寿命）和乙酰胆碱（寿命）浓度的变化，如下所述。使用高效液相色谱（HPLC）检测和ELISA（落基山诊断）分析评估儿茶酚胺浓度，如下所述。

LPS和胰岛素抵抗之间的联系在文献中有很详细的描述，在细菌感染期间经常观察到高血糖和高胰岛素血症是患者不良临床结果的指标。因此，为了观察LPS和US治疗对血糖和胰岛素水平的影响，从0、15、30和60岁时的尾静脉采集血样 注射LPS后min。使用OneTouch Elite血糖仪（LifeScan；强生）测量血糖浓度。使用ELISA试剂盒（Crystal Chem）测定从血液中获得的血浆中的胰岛素浓度。通过评估肝脏、肌肉、心脏和下丘脑组织样本中的关键生物标记物（包括p38、p7056k、Akt、GSK3B、c-Src、NF-κβ、SOCS3、IRS-1、NPY和POMC）来测量信号转导的变化。

小鼠

所有小鼠实验均按照诺思韦尔卫生系统范斯坦医学研究所动物护理和使用委员会批准的方案进行。动物被安置在25岁 °C，光/暗循环12小时，并在进行实验之前至少适应1周。水和常规啮齿动物食物可以随意使用。野生型C57black/6小鼠、裸鼠（nu/nu）、α7烟碱受体敲除小鼠（B6.129S7-Chrna7tm1Bay，编号003232）、ChAT-floxed小鼠（B6.29-Chattm1Jrs/J）和在内源性CD4启动子（CD4-Cre）控制下表达Cre重组酶的小鼠，8-12周龄（20-25周龄） g） 从杰克逊实验室（美国ME州巴尔港）购买。将ChAT-floxed和CD4-Core小鼠杂交，在CD4+群体中产生基因缺失ChAT的小鼠。

儿茶酚胺消耗

溶于冰乙酸（Sigma–Aldrich）中的利血平（Sigma-Aldrich。小鼠腹腔注射利血平（10 mg/kg）利血平24 实验开始前h。

超声波刺激协议

超声神经调节的方案如下。用2-4%异氟醚麻醉动物。在手术过程中，动物被放在一个水循环暖垫上，以防止体温过高。刺激前，用一次性剃须刀和动物剪刀将U/S刺激指定点（感兴趣神经）上方的区域剃光。使用Vivid E9诊断成像超声系统确定感兴趣区域，如下所示。肝脏：肝门静脉的多普勒识别显示为肝门。脾脏：通过诊断超声对脾脏进行目视识别。刺激物的位置沿脾轴保持不变。该区域用一个永久性标记进行标记，以便日后识别。使用研究FUS系统进行超声刺激。将U/S探头放置在诊断超声探头识别的指定感兴趣区域（补充图1和4). 然后应用U/S刺激，单个刺激的总持续时间不超过单个1 最小脉冲。任何时候都不允许能量达到与热损伤和烧蚀/空化相关的水平（35 宽/厘米2烧蚀/空化）。LPS（10 mg/kg），然后注射IP（用于急性/动力学研究）。或者，在有效期内，此处不注射LPS，而是在稍后指定的时间点注射。然后可以施加第二个1分钟的US刺激。

然后，由于LPS的浓度相当于LD75剂量，允许动物在麻醉下孵育急性（1小时）和动态（变化最大可达3 h LPS后）研究。孵化后，对动物实施安乐死，并按如下所述采集组织和血样。在效果研究的持续时间内，不在U/S刺激时注射LPS，而是在施加U/S激励后的指定延迟时间注射LPS（例如0.5、1、2、4、8、24或48 h） 。延迟后，将动物放入麻醉室并进行监测，直到安乐死和组织/液体收集。

组织采集和样品制备

从腹膜腔底部开始切开，向上延伸至胸膜腔。快速移除器官（包括脾脏和肝脏）并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中均质，该溶液含有磷酸酶（0.2-mM苯甲基磺酰基氟化物、5-µg/mL抑肽酶、1-mM苯甲脒、1mM原钒酸钠和2-µM斑蝥素）和蛋白酶（1-µL至20 按照Roche Diagnostics）抑制剂的规定，使用mg组织。在所有样品中应用0.2g组织/mL PBS溶液的最终目标浓度。血液样本用抗凝剂二钠（乙二腈）四乙酸（EDTA）保存，以防止样本凝固。然后将样品储存在−80 °C直到分析。

高效液相色谱分析

血清样本直接注入机器，无需预处理。组织匀浆最初用0.1-M高氯酸均质并离心15 min，然后分离上清液，并将样品注入HPLC。儿茶酚胺、去甲肾上腺素和肾上腺素采用HPLC和在线紫外检测器进行分析。本分析中使用的测试柱是Supelco Discovery C18（15厘米 × 4.6-mm内径，5-µm粒径）。由[A]乙腈：[B]50组成的双相流动相 = 毫微米千赫2人事军官4，设置为pH 3（使用磷酸）。然后用100 mg/L EDTA和200 mg/L 1-辛烷磺酸缓冲溶液。流动相混合物的最终浓度设置为5:95，A:B。流速为1 用mL/min提高总的峰分辨率，同时将色谱柱保持在一致的20 °C，以将所用流动相的粘度导致的色谱柱压力压实降至最低。紫外检测器保持在254-nm波长，已知其能够捕获儿茶酚胺的吸收，包括去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺。

免疫组织化学和组织学方案

组织提取和石蜡块转化如下。立即将组织（鼠脑）放入固定剂中并固定~24 在10%福尔马林中4小时 摄氏度。按照以下方案处理组织（每次培养期间使用真空和压力）：70%乙醇，37 摄氏度，40 最小值，80%乙醇，37 摄氏度，40 最小值，95%乙醇，37 摄氏度，40 最小值，95%乙醇，37 摄氏度，40 最小值，100%乙醇，37 C、 40个 最小值，100%乙醇，37 摄氏度，40 最小值，二甲苯，37 摄氏度，40 最小值，二甲苯，37 摄氏度，40 最小值，石蜡，65 摄氏度，40 最小值，石蜡，65 摄氏度，40 最小值，石蜡，65 摄氏度，40 最小值，然后将样品留在石蜡中，直到准备好嵌入（不超过12–18 h） ●●●●。

嵌入石蜡块进行切片，切片前让石蜡块冷却/硬化。第5部分-µm厚，浮于50 °C水浴收集。使用带正电荷的载玻片，并尝试将组织放置在每张载玻片的相同方向。风干幻灯片。在室温下过夜似乎是最好的干燥方式，但幻灯片可以放在40 °C的玻片加温器可加快干燥过程，但将玻片放置在加温器上的时间不要超过一个小时。将幻灯片存储在4 摄氏度。

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样品（大鼠大脑）在65℃烘烤 1°C h.用二甲苯将载玻片脱蜡，通过降低乙醇浓度洗涤液进行再水化，然后处理以回收抗原。开发了一种两步抗原检索方法，专门用于与FFPE组织多路复用，允许在同一样本上使用具有不同抗原检索条件的抗体。然后在PBS中用0.3%Triton X-100培养样品10 在1×PBS中阻断10%（wt/vol）驴血清和3%（wt/vol）牛血清白蛋白（BSA）与非特异性结合之前，在环境温度下保持45分钟 室温下的最小值。将初级抗体c-Fos（Santa Cruz-SC52；sc-166940）稀释至最佳浓度（5 μg/mL），适用于1 在PBS/3%（vol/vol）BSA中室温下清洗h。然后在PBS、PBS-TritonX-100中依次清洗样品，然后再次在PBS中清洗10 min，每次搅拌。在二级抗体检测的情况下，样品与与Cy3或Cy5结合的一级抗体种特异性二级驴IgG孵育。然后按照上述方法清洗载玻片，并在DAPI中染色（10 μg/mL），适用于5 分钟，再次在PBS中漂洗，然后用抗褪色介质固定用于图像采集。在荧光显微镜（Olympus IX81）上获取全组织图像 ×10倍放大。自体荧光是FFPE组织的典型特征，需要正确表征并与靶荧光信号分离。我们使用了自荧光去除过程，其中除了染色图像外，还获得了未染色样品的图像。根据曝光时间和暗像素值（零曝光时间的像素强度值）对未染色和染色图像进行归一化。然后从相应的归一化染色图像中减去每个归一化自荧光图像。我们确保对受刺激样品和对照样品中的相同区域进行成像。

受刺激组织的组织学评估

如上所述，将受刺激大鼠和对照大鼠的脾脏加工成石蜡块。按照文献报道的标准方案，对石蜡包埋切片进行清理和H&E染色，并在亮场扫描仪（Olympus）上进行扫描。对H&E图像进行形态学差异的定性评估，刺激样品和对照样品之间未发现显著差异（补充图7).

交替脉冲重复周期和脉冲幅度

超声刺激动物的血糖和/或脾脏NE、ACH和TNF浓度数据（附图8–10)或不带（补充图7)LPS注射）使用替代超声模拟参数与正文中给出的参数进行了比较。我们评估了超声神经调节对幼稚/非脂多糖治疗动物的影响（补充图7)和接受交替脉冲重复周期和脉冲长度治疗的动物（补充图中的结果摘要8–10).

基于电极的迷走神经刺激（VNS）协议

雄性Sprague-Dawley大鼠用2-4%异氟醚麻醉。沿着颈部切开一个切口，暴露斜方肌、胸锁乳突肌和咬肌的颈部，钝性剥离暴露左侧颈迷走神经。微电极沿暴露的颈迷走神经主干放置。使用三种设置进行电刺激（5 五、 30个 赫兹，2 毫秒；5 五、 5个 赫兹，2 毫秒；和1 五、 5个 赫兹，2 ms）是在AcqKnowledge软件（BIOPAC Systems）的控制下，使用BIOPAC MP150模块生成的。大鼠接受3次 在IP注射10mg/kg LPS之前和之后的VNS分钟。注入10后 mg/kg LPS，使用盐水浸泡垫使该区域水合，并缝合颈部区域以保持生理部位的完整性。对大鼠实施安乐死60 如上所述注射LPS后min，取脾脏和血液样本进行如上所述的TNF测定。在接受假手术的大鼠中，迷走神经被暴露，但未被触摸或操纵。

心率监测和分析

使用商用红外血氧计和生理监测系统（Starr Lifesciences）按照制造商的说明监测心率（在超声或电极刺激实验期间）。在刺激方案中，将脚夹传感器（由制造商提供）放置在动物的脚垫上。这只动物被允许至少适应5年 在测量前分钟，发现一个时间点足以让动物恢复正常心率活动和对照组的生理读数。在电微电极或超声波探头刺激之前（2分钟记录期）、期间和之后（2分钟录制期）记录测量值。

cFos分析和其他US-induced activation措施

将LPS-U/S刺激和假动物迅速安乐死，取出大脑并转移到10%多聚甲醛中24小时 h、 然后将其转移到30%蔗糖溶液中并保存4 石蜡包埋前的°C（详见上述IHC部分）。冠状切面（5-10 µm）通过低温恒温器切割。根据解剖图谱对结构进行了解剖学定义。实验人员在不了解与每个不同冠状面相关的治疗条件的情况下，通过至少四个断面的固定样本窗口对c-Fos阳性细胞的定量进行计数。感兴趣的区域如下：室旁下丘脑核、ARC、VMN、DMN、LH和乳头丘脑束（在Bregma−2.56至−3.60之间拍摄的冠状切片中所有可见的结构 毫米）。与Sham模拟的对照窝友相比，各组c-Fos阳性细胞的数量以cFos+细胞的百分比表示。

除了在主要Bregma−11.3至−14.08中进行的下丘脑特异性cFos训练分析外 mm，文本/数字，团队对NTS内超声诱导的激活进行了分段和分析。NTS是一种脑干核，已知其含有纯感觉核（包括迷走神经纤维），并投射到大脑中参与自主调节的区域（包括下丘脑；见补充图11了解这些神经通路的描述）。在超声刺激的动物中，激活特异性标记物的染色增加（图7)与其他研究结果（即下丘脑神经递质和蛋白质数据以及MRI数据）一致，并表明超声波可以诱导下丘脑代谢控制中心的神经介导调节。此附加补充数据（补充图12)表明这种超声效应至少部分是通过直接感觉途径介导的。

扩散功能MRI

神经元激活通常使用血氧水平依赖性（BOLD）fMRI检测54; 代谢需求增加的大脑区域导致脑血流量增加，含氧血液供应增加，梯度回波信号减少。对BOLD效应的敏感性要求使用快速梯度回波采集；这会导致气穴附近的脑区（如鼻窦和耳道）出现意外信号丢失，并阻碍对这些特定脑区附近神经元激活的检测。或者，为了最大限度地减少大场不均匀区域的信号损失，可以使用自旋回波（或双自旋回波）扩散加权成像（DWI）检测神经元的激活44–46或由外部神经调节剂驱动的神经激活47在DWI-fMRI中，慢扩散（可能是细胞内）水池的体积增加或水扩散（或ADC）的增加被认为是神经元激活引起的物理变化。

10只Sprague-Dawley大鼠使用3%异氟醚麻醉，仰卧，头部插入鸟笼线圈。腹部区域通过凝胶/充水锥连接到MR兼容的U/S探头(（f） = 1.47 MHz），聚焦于肝门，肝门是一个已知含有葡萄糖敏感神经元的肝脏区域。补充图第13页描述了实验装置的示意图，包括连接到RF放大器/信号发生器的US探头。

数据通过3T扫描仪（MR750，GE Healthcare）采集。采集SPGR T1后，采集6块DWI图像，TE/TR为82/3400 ms，使用3/4平均值b条 = 0/b条 = 1000 秒/毫米2以及0.6/1-mm平面内/平面外空间分辨率。为了校正失真，采集了额外的反极性DWI采集55在注射LPS、第一次超声治疗、等待时间和第二次超声治疗后，又采集了6块DWI图像。每次超声治疗持续60 s、 在此期间，方波脉冲施加在150/350-μs开/关周期。焦点处的声压约为3.2 兆帕。补充图13亿描述了实验时间的总结。该方案适用于6只大鼠；对于剩下的4个，最后一个DWI区块紧随LPS注射之后，没有进行US治疗。

A互相关系数(中央控制中心)T1图像和之间（畸变校正）b条 = 使用至少0.5的0 DWI图像来识别用于进一步分析的切片。计算治疗前后图像的ADC；将治疗前后的图像数据汇集在一起进行统计分析。T1图像和大鼠图谱之间的刚性配准用于确定像素逐个像素的区域t吨-测试表明发生了重大变化。将T1和寰椎图像的配准变换应用于畸变校正的DWI和ADC图像。

补充图14显示了T1的示例/b条 = 畸变校正后一只大鼠获得0 DWI；仅满足红色高亮显示的切片中央控制中心 > 0.5，留作统计分析。为了观察脂多糖和超声治疗对血糖水平的影响，在第一次核磁共振扫描之前和30 注射LPS后min；使用OneTouch Elite血糖仪（LifeScan；强生）测量血糖浓度。

图7亿显示了激活贴图/SPGR卷（左侧）和图集/SPGR体积（右侧）之间的重叠示例。注意下丘脑两个PVN的ADC变化（红色箭头，左图），与超声诱导的神经调节一致。图7天在条形图和补充表中总结结果2详细说明了所有10只动物的明确结果。六只大鼠中有三只在PVN中表现出明显的神经调节作用；对照动物的神经活动没有出现这种变化。此外，在非美国治疗动物中观察到的高血糖在美国治疗的动物中没有观察到。

补充信息

补充信息（150万，pdf）

致谢

作者感谢Jim E.Rothman（耶鲁医学院）对研究策略和手稿的咨询和深思熟虑的评论。这项工作得到了通用电气风险投资公司（Catalyst）在范斯坦医学研究所建立生物电子医学中心（CBEM）的投资。这项研究的一部分是由国防高级项目局（DARPA）HR0011-18-0040资助开发的。所表达的观点、意见和/或调查结果均为作者的观点、观点和/或研究结果，不应被解释为代表国防部或美国政府的官方观点或政策。

作者贡献

C.P.、J.A.和V.C.设计了研究计划，进行了实验，并撰写了手稿。S.S.C.和K.J.T.设计了小鼠实验，分析了数据，并协助进行了手稿审查。T.T.、A.M.K.和S.S.C.进行了小鼠实验。Y.F.、S.K.、J.R.、P.F.和J.G.进行了实验并分析了数据。Y.F.、K.W.、W.R.和T.-J.K.准备了超声刺激设备和实验界面。I.H.协助设计MRI实验、MR图像分析和手稿的MR部分。C.B.和S.J.协助MR图像分析。T.R.C.和S.Z.协助设计了LPS模型实验、临床前支持和小鼠研究以及手稿审查。

数据可用性

本研究期间生成或分析的数据尽可能在已发表的文章中提供（及其补充信息文件）；在当前研究期间生成和/或分析的任何数据集也可以根据合理要求从相应作者处获得。手稿中使用的显微镜图像已在https://datadryad.org（10.5061/dryad.md888qr）。

竞争性利益

V.C.、Y.F.、I.H.、P.F.、K.W.、S.K.、J.G.、W.R.、T.-J.K.、JR.、C.B.、S.J.、J.A.和C.P.是通用电气的员工，并声明通用电气已提交美国和国际专利申请，描述基于精密组织的U/S神经调节的方法、装置和系统。T.T.、A.M.K.、T.R.C.、S.Z.、K.J.T.和S.S.C.声明，通用电气提供资金支持其与本手稿相关的工作。所有其他作者都声明没有相互竞争的利益。

脚注

期刊同行评议信息： 自然通讯感谢匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。

出版商备注：Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

更改历史记录

3/9/2020

本文的修订版已经出版，可以通过论文顶部的链接访问。

电子补充材料

补充信息本文随附于10.1038/s41467-019-08750-9。

工具书类

1Olofson PS，Tracey KJ。生物电子医学：针对治疗的分子机制的技术。J.实习生。医学。2017;282:3–4. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2Birmingham K等人，《生物电子药物：研究路线图》。国家药品监督管理局。2014;13:399–400.[公共医学][谷歌学者]
三。Koopman FA等。迷走神经刺激抑制细胞因子的产生并减轻类风湿关节炎的疾病严重程度。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2016;113:8284–8289. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4维克多·RG。颈动脉压力反射激活治疗顽固性高血压。Nat.Rev.Cardiol公司。2015;12:451–463.[公共医学][谷歌学者]
5Meyers EE，Kronemberger A，Lira V，Rahmouni K，Stauss HM。传入和传出迷走神经刺激对胰岛素分泌和血糖调节的对比作用。生理学。代表。2016;4：e12718。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6弗吉尼亚州巴甫洛夫，Tracey KJ。迷走神经与炎症反应相关的免疫和代谢。Nat.Rev.内分泌。2012;8:743–754. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Bonaz B，Sinniger V，Pellissier S.迷走神经刺激：炎症性肠病的一种新的有希望的治疗工具。J.实习生。医学。2017;282:46–63.[公共医学][谷歌学者]
8Browning KN，Verheijden S，Boeckxstaens GE。迷走神经在食欲调节、情绪和肠道炎症中的作用。胃肠病学。2017;152:730–744. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9科根SF。神经刺激和记录电极。每年。生物识别版本。工程师。2008;10:275–309.[公共医学][谷歌学者]
10Borovikova LV等。迷走神经刺激可减轻内毒素引起的全身炎症反应。自然。2000;405:458–462.[公共医学][谷歌学者]
11Johnson MI，Walsh DM。疼痛：TENS缓解疼痛效果的持续不确定性。自然修订版风湿病。2010;6:314–316.[公共医学][谷歌学者]
12Frangos E，Ellrich J，Komisaruk BR。通过外耳电刺激非侵入性接触迷走神经中枢投射物：人类的FMRI证据。大脑刺激。2015;8:624–636. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Dayan E、Censor N、Buch ER、Sandrini M、Cohen LG。非侵入性脑刺激：从生理学到网络动力学，再回来。自然神经科学。2013;16:838–844. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Temel Y，Jahanshahi A.通过神经调节治疗脑部疾病。科学。2015;347:1418–1419.[公共医学][谷歌学者]
15Jun JJ等。用于高密度记录神经活动的全集成硅探针。自然。2017;551:232. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Chen R、Romero G、Christiansen MG、Mohr A、Anikeva P.无线磁热深部脑刺激。科学。2015;347:1477–1480.[公共医学][谷歌学者]
17Fattahi P，Yang G，Kim G，Abidian MR.神经界面用有机和无机生物材料综述。高级主管。2014;26:1846–1885. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Mei H，Irazoqui PP.微型无线植入物。自然生物技术。2014;32:1008.[公共医学][谷歌学者]
19Tracey KJ。免疫的反射控制。国家免疫学修订版。2009;9:418–428. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20特蕾西·KJ。免疫力反射。单元格。2016;164:343–344.[公共医学][谷歌学者]
21Bassi GS等。迷走神经感觉和中枢脑刺激对实验性关节炎的调节。大脑行为。免疫。2017;64：330–343。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Martelli D，McKinley MJ，McAllen RM。胆碱能抗炎途径：评论。自动。神经科学。2014;182:65–69.[公共医学][谷歌学者]
23Juan EJ、González R、Albors G、Ward MP、Irazoqui P.使用聚焦脉冲超声对迷走神经的调制：在大鼠中的潜在应用和初步观察。国际成像系统杂志。Technol公司。2014;24:67–71. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Schelling G，Delius M，Gschwender M，Grafe P，Gambihler S。体外冲击波通过空化介导机制间接刺激青蛙坐骨神经。生物物理学。J。1994;66:133–140. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Wright CJ、Haqshenas SR、Rothwell J、Saffari N.可以使用脉冲超声刺激无髓周围神经。超声医学生物学。2017;43：2269–2283。[公共医学][谷歌学者]
26Colucci V，Strichartz G，Jolesz F，Vykhodtseva N，Hynynen K。聚焦超声对神经动作电位的影响。超声医学生物学。2009;35:1737–1747. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Downs ME等。通过聚焦超声在体内进行非侵入性周围神经刺激。物理学。医学生物学。2018;63:35011.[公共医学][谷歌学者]
28Kim H等。聚焦超声对大鼠外展神经的无创经颅刺激。超声医学生物学。2012;38:1568–1575. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Tyler WJ等。使用低强度、低频超声波远程激发神经元回路。公共科学图书馆一号。2008;三：e3511。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Menz MD、Oralkan Ouml、Khuri-Yakub PT、Baccus SA。使用聚焦超声对视网膜进行精确的神经刺激。《神经科学杂志》。2013;33:4550–4560. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Gigliotti JC等。超声波通过刺激脾胆碱能抗炎途径预防肾缺血再灌注损伤。《美国肾脏学会杂志》。2013;24:1451–1460. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32O'Hare JD，Zsombok A.脑-肝连接：自主前PVN神经元的作用。美国生理学杂志。Metab公司。2015;310：E183–E189。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Sharif O、Bolshakov VN、Raines S、Newham P、Perkins ND。LPS诱导巨噬细胞NF-kappaB反应的转录谱。BMC免疫学。2007年；8:1–17. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Sun P等。MAPK/NF-κB信号转导在慢性迷走神经刺激引起的实验性结肠炎胆碱能抗炎途径激活中的作用。公共科学图书馆一号。2013;8：e69424。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Parameswaran N，Patial S.巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α信号传导。批评。真核生物评论。基因表达。2010;20:87–103. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Wang H等。烟碱乙酰胆碱受体α7亚单位是炎症的重要调节器。自然。2002;421:384.[公共医学][谷歌学者]
37Yi CX，la Fleur SE，Fliers E，Kalsbeek A.自主神经肝脏神经支配在控制能量代谢中的作用。生物化学。生物物理学。《学报》。2010;1802:416–431.[公共医学][谷歌学者]
38Cani PD等。代谢性内毒素血症引发肥胖和胰岛素抵抗。糖尿病。2007年；56:1761–1772.[公共医学][谷歌学者]
39Kahn SE，Hull RL，Utzschneider KM。肥胖与胰岛素抵抗和2型糖尿病之间的联系机制。自然。2006年；444:840–846.[公共医学][谷歌学者]
40捷克议员。胰岛素在肥胖和2型糖尿病中的作用和抵抗。自然医学。2017;23：804–814。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Pocai A、Obici S、Schwartz GJ、Rossetti L.脑-肝回路调节葡萄糖稳态。单元格元数据。2005;1:53–61.[公共医学][谷歌学者]
42Loh K、Herzog H、Shi YC。NPY系统对能量稳态的调节。内分泌趋势。Metab公司。2015;26:125–135.[公共医学][谷歌学者]
43Reyes TM、Walker JR、DeCino C、Hogenesch JB、Sawchenko PE。分类不同的急性应激源在下丘脑室旁核引发不同的转录谱。《神经科学杂志》。2003;23：5607–5616。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Abe M、Fukuyama H、Mima T。水扩散揭示了重复脑刺激后调节多区域形态可塑性的网络。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2014;111:4608–4613. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Le Bihan D、Urayama SI、Aso T、Hanakawa T、Fukuyama H。用扩散MRI直接快速检测人脑神经元激活。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006年；103:8263–8268. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46Tsurugizawa T，Ciobanu L，Le Bihan D。大脑皮层的水扩散密切跟踪潜在的神经元活动。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2013;110:11636–11641. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47Bai R、Stewart CV、Plenz D、Basser PJ。评估扩散MRI直接检测神经元活动的敏感性。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2016;113：E1728–E1737。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48Gross D、Coutier C、Legros M、Bouakaz A、Certon D。超声引导聚焦超声靶向治疗的cMUT探头。IEEE传输。超声波。铁电极。频率控制。2015;62:1145–1160.[公共医学][谷歌学者]
49Surappa S、Satir S、Levent Degertekin F。基于参数共振的电容式超声波换能器。申请。物理学。莱特。2017;111:43503. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
50Chiu CT、Kang BJ、Eliahoo P、Abraham T、Shung KK。干涉制导用20-MHz微线阵换能器的制造和表征。IEEE传输。超声波。铁电极。频率控制。2017;64:1261–1268. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Wright CJ，Rothwell J，Saffari N.周围神经组织超声刺激：机制研究。《物理学杂志》。Conf.序列号。2015;581:12003. [谷歌学者]
52费里尔·洛雷托（Feril Loreto B.）、卡苏罗（Tachibana Katsuro）、小川晃一（Ogawa Koichi）、山口县（Yamaguchi Kazuki）、索拉诺·伊凡（Solano Ivan G.）、艾丽·尤塔卡。低强度超声的治疗潜力（第1部分）：热效应和声机械效应。医学超声杂志。2008;35（4） ：153–160。[公共医学][谷歌学者]
53Huang H，Delikanli S，Zeng H，Ferkey DM，Pralle A.通过纳米颗粒的磁场加热远程控制离子通道和神经元。自然纳米技术。2010;5:602.[公共医学][谷歌学者]
54Logothetis NK公司。BOLD功能磁共振成像信号的基础。《神经科学杂志》。2003;23:3963–3971. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
55Holland D，Kuperman JM，Dale AM。回波平面成像中非均匀静磁场诱导畸变的有效校正。神经影像学。2010;50:175–183. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自自然通讯由以下人员提供自然出版集团