跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
癌症科学。2019年5月;110(5): 1665–1675.
2019年3月23日在线发布。 数字对象标识:10.1111/卡斯.13989
预防性维修识别码:项目经理6500984
PMID:30844110

缺氧诱导因子-1α和核因子‐κB在表皮生长因子受体突变体调控非小细胞肺癌细胞程序性死亡配体1表达中发挥重要作用

摘要

一些驱动基因突变,包括表皮生长因子受体(表皮生长因子受体),据报道参与免疫抑制检查点蛋白编程细胞死亡配体1的表达调控(PD公司‐L1),但其潜在机制仍不清楚。我们研究了表皮生长因子受体突变体PD公司非小细胞肺癌中L1的表达调控(非小细胞肺癌)单元格。枢轴的检查表皮生长因子受体8中的信号效应器非小细胞肺癌细胞系表明PD公司‐L1过度表达和磷酸化阿克特ERK公司尤其是随着磷酸化IκBα(p‐IκAα)和缺氧诱导因子-1α(HIF‐1α)蛋白水平的增加。流式细胞术结果显示,细胞膜共表达更强的表皮生长因子受体PD公司‐L1英寸非小细胞肺癌包含的单元格表皮生长因子受体突变体与携带WT的细胞的比较表皮生长因子受体此外,异位表达或缺失表皮生长因子受体突变体和用表皮生长因子受体靶向通路抑制剂甲乙酮/ERK公司,圆周率3公里/阿克特,mTOR公司/S6、IκBα和高强度聚焦‐1α表明PD公司‐L1、p-IκBα和高强度聚焦‐1α英寸非小细胞肺癌细胞。进一步使用通路抑制剂治疗可显著抑制异种移植瘤生长和p‐IκBα,高强度聚焦‐1α,和PD公司‐L1表达非小细胞肺癌细胞携带表皮生长因子受体裸鼠中的突变。此外,免疫组化分析显示p‐IκBα的蛋白水平明显增加,高强度聚焦‐1α,和PD公司‐L1英寸非小细胞肺癌带有的组织表皮生长因子受体与携带WT的组织相比的突变体表皮生长因子受体具有p‐IκBα或高强度聚焦‐1α阳性染色更可能升高PD公司与组织相比,L1表达的p‐IκBα和高强度聚焦‐1α. 我们的发现显示了磷酸化激活阿克特ERK公司以及法国试验标准‐κB和高强度聚焦‐1α英寸PD公司‐L1表达调控表皮生长因子受体突变体非小细胞肺癌.

关键词:表皮生长因子受体、缺氧诱导因子-1α、NF-κB、非小细胞肺癌、程序性细胞死亡配体1

缩写

模数转换器
腺癌
自动功率控制
别藻蓝蛋白
表皮生长因子受体
表皮生长因子受体
HIF‐1α
缺氧诱导因子-1α
IKK公司
IκB激酶
非小细胞肺癌
非小细胞肺癌
核因子κB
核因子‐κB
p‐
磷酸化的
PD‐1
程序性细胞死亡1
PD‐L1
程序性细胞死亡配体1
体育课
藻红蛋白
合同专用条款
鳞状细胞癌
TKI公司
酪氨酸激酶抑制剂

1简介

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。每年约有130万新病例和120万人死于肺癌。1非小细胞肺癌约占肺癌病例的80%。2自21世纪初以来,EGFR‐TKIs等分子靶向治疗在非小细胞肺癌患者中显示出良好的疗效。然而,由于原发性或继发性耐药,非小细胞肺癌的总体5年生存率没有明显提高。,4因此,迫切需要新的肺癌治疗方法。

最近,单克隆抗体针对PD‐1共抑制受体及其适配器编程死亡配体1(PD‐L1)的免疫治疗在治疗各种晚期肿瘤(包括非小细胞肺癌)方面取得了重大突破。5,6程序性细胞死亡-1属于CD28家族,是一种主要在活化T细胞上表达的I型跨膜蛋白。其配体PD‐L1属于B7家族,广泛表达于树突状细胞、巨噬细胞、活化的T和B细胞以及包括癌细胞在内的非免疫细胞。7,8作为重要的免疫检查点分子,PD-1/PD-L1相互作用通过诱导T细胞凋亡、无能、衰竭和调节各种细胞因子的分泌,抑制效应T细胞的生长和功能。9,10据报道,PD-L1过度表达的肿瘤细胞与攻击行为和疾病控制和治疗结果恶化有关。11,12,13

越来越多的证据阐明了肿瘤细胞中PD-L1表达调控的内在和外在机制。14炎症细胞因子,如IFN‐γ,可以通过MEK/ERK或JAK/STAT途径诱导PD‐L1表达。15,16这个EML4‐ALK公司据报道,融合基因以及Lkb1和PTEN的缺失参与了非小细胞肺癌中PD‐L1表达的内在调节。17,18突变的表皮生长因子受体是非小细胞肺癌中最重要的驱动基因,高达47.9%的亚洲患者携带该基因表皮生长因子受体,使突变对EGFR‐TKIs敏感。192013年,Akbay等人20首先表明表皮生长因子受体支气管上皮细胞突变诱导PD‐L1表达,以促进EGFR驱动的肺部肿瘤的免疫逃逸。2015年,D'Incecco等人21据报道,在125名NSCLC患者的队列中,PD-L1阳性表达与EGFR突变显著相关。然而,PD-L1表达调控的潜在作用和精确分子机制表皮生长因子受体突变体仍有待探索。

在本研究中,我们研究了一组NSCLC细胞中的EGFR状态、关键EGFR信号级联的激活和PD-L1表达,并观察到PD-L1过度表达与ERK和AKT磷酸化激活之间的明显关联,尤其是随着p‐IκBα和HIF‐1α蛋白水平的增加。此外,我们进行了流式细胞术分析,以检测不同EGFR状态的NSCLC细胞中EGFR和PD‐L1的细胞表面表达。此外,WT的异位表达或耗竭表皮生长因子受体表皮生长因子受体利用突变体或特异性通路抑制剂阐明EGFR对NSCLC细胞或异种小鼠模型中PD‐L1表达的调控机制。在149例人类非小细胞肺癌组织样本中进一步分析了EGFR状态、p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1蛋白水平之间的相关性。

2材料和方法

2.1. 细胞系和细胞培养

人类非小细胞肺癌细胞H522、H661、HCC827、H1299、HCC2935、H1650、H1792和H1975来自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯,美国)。细胞在添加有10%FBS和1%青霉素/链霉素储备的RPMI‐1640培养基中培养,并在5%CO的湿化环境中培养2温度为37°C。

2.2. 主要试剂和抗体

MEK/ERK抑制剂U0126、PI3K/AKT抑制剂LY294002、NF‐κB抑制剂BAY11‐7082、mTOR抑制剂雷帕霉素和HIF‐1α抑制剂PX‐478来自Selleck Chemicals(美国德克萨斯州休斯顿)。抗EGFR[EP38Y]的主要抗体(ab52894)、p-ERK1/2、pT202/pT204)(ab50011)、ERK1/2(ab17942)、HIF‐)α(ab51608)、PD‐L1(ab205921)、,他的标签(ab18184)和Actin(ab8226)是从Abcam(英国剑桥)购买的,Abs针对p‐AKT(Ser473)(#4060)、AKT(#4691)、p‐S6(Ser235/236)(#4858)、S6(#2217)和p‐IκBα(Ser32/36)(#9246)是从Cell Signaling Technology(美国马萨诸塞州贝弗利)购买的。此外,用于流式细胞术分析的两种主要Abs,PE‐PD‐L1(557924)和APC‐EGFR(563577),以及它们各自的同种型对照Abs,PE小鼠IgG1(κ同种型对照,555749)和APC小鼠IgG2b(κ同种型对照,557903),都是从BD Biosciences(美国加利福尼亚州圣何塞)获得的。

2.3. 表达载体与siRNA转染

包含重要表皮生长因子受体突变体是通过亚克隆表皮生长因子受体将带有e19del、e19del+T790M、L858R和L858R+T790 M的基因导入pcDNA3.1‐His‐Xpress载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。所有结构都进行了限制映射和排序。

靶向表皮生长因子受体基因(si-EGFR)22,23由北京奥科峰生物技术有限公司(中国北京)合成。如前所述进行表达载体和siRNA转染。24简单地说,将指数增长的NSCLC细胞接种到6孔板(2×105细胞/孔)。第二天,将每个表达载体或siRNA序列的2μg与6μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)和250μL Opti‐MEM培养基(Invit罗gen)混合20分钟,然后添加到细胞中。空白载体和不匹配的siRNA转染被用作对照。转染后48小时,收集细胞进行进一步分析。

2.4. 流式细胞术

收集NSCLC细胞,在冷流式细胞术染色缓冲液(含0.2%[w/v]BSA的PBS)中洗涤两次,然后用冷染色缓冲液重新悬浮至最终浓度1×106细胞/100μL。将细胞悬浮液等分到每管100μL中,加入初级Abs,PE‐PD‐L1和APC‐EGFR,并在黑暗中在冰上孵育30分钟。根据制造商的说明使用各自的同种型对照Abs,PE小鼠IgG1和APC小鼠IgG2b。用染色缓冲液清洗细胞两次,以去除未结合的抗体,然后用流式细胞仪(Accuri C6;BD Biosciences)进行分析。侧面散射和前向散射剖面用于消除细胞倍增。细胞常规分类两次,数据用BD-Accuri C6软件进行分析。

2.5. 通路抑制实验

选择携带EGFR的H1975细胞(L858R+T790M)进行EGFR通路抑制实验。H1975细胞接受2个剂量(1×和3×)的每种途径抑制剂(3和9μmol/L U0126、15和45μmol/LY294002、4和12 nmol/L雷帕霉素、2.5和7.5μmol/L BAY11‐7082、25和75μmol/LPX‐478)。我们使用DMSO处理的细胞作为对照。治疗48小时后,提取细胞总蛋白进行进一步分析。

2.6. 蛋白质印迹分析

用添加蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液将处理过的细胞在冰上裂解25分钟,然后在14000℃下离心清除溶液持续20分钟。使用BCA蛋白检测试剂盒对总蛋白浓度进行量化,在10%-12%的SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质(20‐40μg/条),并将其电转移至PVDF膜。然后用5%脱脂奶封闭膜,并用特定的一级抗体进行探测:抗EGFR、抗p-ERK1/2(pT202/pT204)、抗-ERK1/2、抗HIF-1α、抗-PD-L1、抗p-AKT(Ser473)、抗-AKT、抗-p-IκBα(Ser32/36)、抗-S6、抗-p-S6(Ser235/236)、抗-His和抗Actin(1:1000-1:5000稀释)。用0.2%吐温20/PBS缓冲液洗涤4次后,用HRP共轭二级抗体培养膜,并使用ECL系统(英国Little Chalfont的GE Healthcare)进行可视化。

2.7. 体内动物模型实验

雌性BALB/c裸鼠(5-6周龄)取自北京维他河实验动物公司(中国北京),并在北京肿瘤医院和研究所实验动物科(中国北京。实验动物的护理符合机构动物护理和使用委员会指南。

将非小细胞肺癌细胞H1975皮下注射到裸鼠(3×10)后肢侧根6单元格/鼠标)。细胞注射的日期指定为第0天。使用数字卡尺每4天监测一次H1975异种移植小鼠模型的肿瘤大小,并根据以下公式计算肿瘤体积:肿瘤体积(mm)=(短轴,单位:mm)2×(长轴单位:mm)×0.52。当肿瘤大小达到100‐150 mm时,小鼠被随机分为5个实验组(每组5只小鼠),分别给予U0126(腹腔注射,剂量为20 mg/kg)、LY294002(腹腔注射剂量为15 mg/kg),BAY11-7082(腹腔注射浓度为5 mg/kg)和PX‐478(腹腔灌胃,剂量为20mg/kg)或等量的二甲基亚砜(用作对照)。所有5种抑制剂在16天内每3天给药一次。在指定日期杀死小鼠并拍摄肿瘤照片。提取各组肿瘤的总蛋白,用western blot分析检测p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1的表达。每个肿瘤的剩余部分常规进行福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片,并进行免疫组织化学检查PD-L1蛋白的表达,如下所述。

2.8. 免疫组织化学分析

为了对p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1的表达进行免疫组织化学分析,从149名在北京肿瘤医院接受手术切除的非小细胞肺癌患者中获取肿瘤样本。还包括从异种移植瘤模型获得的肿瘤组织。所有标本均常规进行福尔马林固定、石蜡包埋,并连续切片,厚度为5μm。

使用链霉亲和素过氧化物酶免疫组织化学方法对所有组织进行染色。简言之,将载玻片在二甲苯中脱蜡,在分级乙醇中再水化,然后用含有3%过氧化氢的PBS处理以阻断内源性过氧化物酶。将载玻片预先培养在10%的山羊血清中以阻止非特异性结合,然后在4°C下分别与针对PD‐L1(ab205921;Abcam)、HIF‐1α(ab51608;Abcam)和p‐IκBα(#9246;细胞信号技术)的特异性初级抗体培养过夜。随后冲洗切片,并用圣克鲁斯生物技术公司(美国加利福尼亚州圣克鲁斯)的生物素结合IgG以1:10 000稀释15分钟,然后用链霉亲和素过氧化物酶结合物培养15分钟。这些信号是用DAB‐H开发的2O(运行)2解决方案。载玻片用5%苏木精复染,然后用光学显微镜检查。未经初步抗体治疗的切片作为阴性对照。非小细胞肺癌标本中PD‐L1、p‐IκBα和HIF‐1α的免疫组织化学评价基于肿瘤细胞染色的强度和程度。在≥5%的肿瘤细胞中,中度至强细胞表面PD-L1表达,≥10%的肿瘤细胞的p‐IκBα细胞质染色,≥10%肿瘤细胞的HIF-1α核染色被定义为阳性结果。25所有NSCLC切片均由2名训练有素的病理学家进行组织病理学检查。

2.9. DNA提取和表皮生长因子受体基因分型

使用手动显微切割法分离所有149份非小细胞肺癌样品的癌组织,并在56°C下在50μL消化缓冲液中培养过夜,消化缓冲液含有10 mg/mL蛋白酶K、0.5%吐温-20、1 mmol/L EDTA、pH 8.0和50 mmol/LT Tris(pH 8.5)。第二天,通过将样品在100°C下培养10分钟,使蛋白酶K失活。DNA样品在−80°C下保存,直至分析。如前所述,EGFR状态也通过使用引物的PCR直接测序确定。26聚合酶链反应以50 ng每个样本DNA为模板进行,并包括阴性对照(不含组织的石蜡块提取切片)。EGFR状态通过使用ABI 3700 DNA测序器(PE Applied Biosystems)直接测序确定。

2.10. 统计分析

使用SPSS 16.0软件(SPSS,芝加哥,伊利诺伊州,美国)确定统计显著性。不同组的连续变量显示为平均值±SD,并使用t吨测验。采用χ2测验。对应P(P)数值<0.05被认为具有统计学意义。

三。结果

3.1. 非小细胞肺癌细胞EGFR信号通路的激活和PD-L1表达

为了研究非小细胞肺癌细胞中EGFR通路的激活与PD‐L1表达之间的相关性,我们在总共8个非小细胞肝癌细胞中检测了EGFR状态和EGFR及其关键下游效应器(p‐ERK1/2、ERK1/2,p‐AKT、AKT、p‐IκBα和HIF‐1α)和PD‐L 1的表达水平。测序结果显示,4个NSCLC细胞具有表皮生长因子受体突变(分别为HCC827、HCC2935和H1650与EGFR[e19del]和H1975与EGFR[L858R+T790M])。如图所示1A、 western blot结果显示,在3个患有以下疾病的NSCLC细胞中,ERK1/2、AKT和IκBα的磷酸化水平明显升高,HIF-1α和PD-L1的表达水平增加表皮生长因子受体与其他携带WT的非小细胞肺癌细胞相比,突变株和EGFR的最高或中度表达(HCC827、HCC2935和H1975)表皮生长因子受体(H522、H661、H1792和H1299)或带有表皮生长因子受体突变但EGFR表达相对较低(H1650)。值得注意的是,在这3个NSCLC细胞系中观察到PD-L1过度表达与p‐IκBα和HIF‐1α蛋白水平的增加有明显的相关性表皮生长因子受体突变体。由于EGFR和PD‐L1在细胞表面表达中起着重要作用,因此使用不同荧光蛋白标记的特异性抗体进行进一步的流式细胞术分析。在3个发生突变的NSCLC细胞系中,EGFR和PD‐L1在细胞表面同时表达的细胞百分比分别为88.9%、55.8%和62.7%表皮生长因子受体(分别为HCC827、HCC2935和H1975),明显高于其余携带WT的NSCLC细胞系表皮生长因子受体(图1B) ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为CAS-110-1665-g001.jpg

表皮生长因子受体的激活(表皮生长因子受体)信号通路与程序性细胞死亡配体1(PD公司‐L1)在非小细胞肺癌中的表达(非小细胞肺癌)单元格。A、 八个人非小细胞肺癌培养细胞株,提取细胞蛋白,进行蛋白质水平的westernblot分析表皮生长因子受体,磷酸化(p‐)ERK公司1/2,ERK公司1/2,p‐阿克特,阿克特,p‐IκBα,缺氧诱导因子‐1α(高强度聚焦-1α),以及PD公司‐L1(顶板)。p‐IκBα的蛋白带,高强度聚焦‐1α,和PD公司‐L1被量化并归一化为内部控制Actin(底部面板)。M、,表皮生长因子受体突变体;W、 重量表皮生长因子受体.B,使用不同荧光蛋白标记的特异性抗体进行流式细胞术分析(自动功率控制表皮生长因子受体体育课PD公司‐L1)用于检测细胞表面的表皮生长因子受体PD公司‐第1页,共8页非小细胞肺癌细胞系。APC,别藻蓝蛋白;PE、藻红蛋白。相应的同种型对照Abs,体育课小鼠IgG1和自动功率控制小鼠IgG2b用作对照

3.2. 激活或抑制EGFR信号通路对NSCLC细胞PD-L1表达调控的影响

比较WT EGFR和不同EGFR的效果表皮生长因子受体PD-L1表达突变体,H661细胞转染WT表皮生长因子受体表皮生长因子受体突变表达载体(e19del、e19del+T790M、L858R和L858R+T790M)。如图所示2A、 WT的异位表达表皮生长因子受体H661细胞中ERK、AKT、S6和IκBα的磷酸化水平以及HIF‐1α和PD‐L1的表达水平显著升高。与WT相比表皮生长因子受体,转染所有4个表皮生长因子受体突变体表现出更强的激活下游信号通路效应物和上调PD-L1蛋白表达的能力。值得注意的是,EGFR(e19del+T790M)或EGFR(L858R+T790M)突变体的转染分别比EGFR(e 19del)和EGFR(L 858R)突变体表现出更强的上调作用。随后特异性siRNA诱导的表皮生长因子受体突变体和WT表皮生长因子受体明显抑制了H1975和H1299细胞中的信号通路激活和PD‐L1表达(图2B、 C)。为了阐明EGFR通路的信号效应器在PD‐L1表达调控中的确切作用,分别使用5种通路抑制剂(U0126、LY294002、雷帕霉素、BAY11‐7082和PX‐478)治疗H1975细胞。如图所示2D、 用5种抑制剂处理后,H1975细胞的p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1的蛋白水平明显降低,并表现出明显的剂量依赖关系,其中BAY11‐7082和PX‐478处理的作用最强。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为CAS-110-1665-g002.jpg

激活或抑制表皮生长因子受体的作用(表皮生长因子受体)程序性细胞死亡配体1的信号通路(PD公司‐L1)在非小细胞肺癌细胞中的表达。A、 转染WT的H661细胞表皮生长因子受体(重量表皮生长因子受体)或表皮生长因子受体突变表达载体(e19del、e19del+T790M、L858R和L858R+T790M)的磷酸化蛋白水平明显升高(p‐)ERK公司,第页阿克特,p‐S6,p‐IκBα,缺氧诱导因子-1α(高强度聚焦-1α),以及PD公司‐L1*P(P)< .01 vs wt‐表皮生长因子受体转染。B、 C特定si核糖核酸(si‐表皮生长因子受体)转染诱导显著下调表皮生长因子受体表达,随后p‐ERK公司,第页阿克特,p-S6,p-IκBα,高强度聚焦‐1α,和PD公司‐L1分别位于H1975(B)和H1299(C)细胞中。D、 H1975细胞接受5种途径抑制剂的2个剂量(1×和3×)处理二甲基亚砜处理过的细胞用作对照。肌动蛋白被用作内部对照,图表显示了p‐IκBα的相对蛋白水平,高强度聚焦‐1α,和PD公司‐L1.3个实验连续变量的平均值±SD*P(P)< .01和**P(P)< .05与二甲基亚砜

3.3. EGFR途径抑制剂治疗抑制异种小鼠模型肿瘤生长和PD-L1表达

为了进一步证明信号效应器(p-ERK、p-AKT、p-IκBα和HIF-1α)在PD-L1表达调控中的作用表皮生长因子受体在NSCLC体内突变,建立了携带H1975细胞的异种移植瘤小鼠模型,并接受相应的通路抑制剂治疗。如图所示A、 与对照组(DMSO)相比,U0126、LY294002、BAY11‐7082和PX‐478治疗组的肿瘤负担显著降低。PX‐478和BAY11‐7082组对肿瘤生长的抑制作用最大。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为CAS-110-1665-g003.jpg

表皮生长因子受体抑制剂(表皮生长因子受体)信号通路抑制肿瘤生长和程序性细胞死亡配体1(PD公司‐L1)在非小细胞肺癌异种移植小鼠模型中的表达。建立携带H1975细胞的异种移植瘤小鼠模型,并接受4种途径抑制剂(U0126、,294002,海湾11‐7082,以及军中福利社‐478)。A、 与对照组相比,所有4个实验组的肿瘤负担均显著降低(二甲基亚砜). B、 C.Western blot分析(B)和免疫组织化学分析(C)表明磷酸化(p‐)IκBα、缺氧诱导因子-1α的蛋白水平(高强度聚焦-1α),以及PD公司‐在所有抑制剂组中,L1均不同程度地显著下调军中福利社‐478和海湾11‐7082显示出最强的抑制作用。原始放大倍数,400×*P(P)< .01和**P(P)< .05与二甲基亚砜

Western blot分析显示,与对照组相比,所有4个通路抑制剂组移植瘤组织中HIF‐1α、p‐IκBα和PD‐L1的蛋白水平均不同程度地显著下调。进一步的免疫组织化学分析证实了每个实验组中PD‐L1蛋白水平的变化。值得注意的是,PX‐478和BAY11‐7082组对PD‐L1表达的抑制作用最强(图B、 C)。

3.4. 非小细胞肺癌组织中EGFR状态、p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1蛋白水平之间的相关性

p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1染色的代表性示例如图所示4根据临床特征、EGFR状态、p‐IκBα蛋白水平和HIF‐1α表达总结了PD‐L1的表达模式,见表1149例NSCLC标本中,共有54例(36.2%)、64例(43.0%)和53例(35.6%)的p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1染色阳性。PD-L1蛋白的表达与临床特征无显著相关性。在p‐IκBα或HIF-1α阳性染色的NSCLC组织中,PD‐L1染色阳性的组织比例远高于p‐IκBα和HIF-1α均阴性染色的组织(44.4%vs 22.0%;P(P)= .005).至于表皮生长因子受体基因分型,PCR扩增在149份非小细胞肺癌样本中的142份中成功表皮生长因子受体在142例NSCLC标本中有46例(32.4%)检测到突变。非小细胞肺癌组织表皮生长因子受体与WT组织相比,突变体的PD‐L1表达阳性率显著增加表皮生长因子受体(47.8%对30.2%,P(P)= .041).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为CAS-110-1665-g004.jpg

磷酸化(p‐)IκBα、缺氧诱导因子-1α的免疫组织化学染色(高强度聚焦‐1α)和程序性细胞死亡配体1(PD公司非小细胞肺癌组织中的L1)蛋白。纳入人类非小细胞肺癌组织(n=149),对p‐IκBα、,高强度聚焦‐1α,和PD公司‐L1蛋白质。p‐IκBα(抗p‐I kb Bα)的阳性表达,高强度聚焦‐1α(抗高强度聚焦-1α),以及PD公司‐L1(反‐PD公司‐L1)分别在细胞质、细胞核和细胞膜中显示为棕色染色。阴性对照组为未经抗体处理的切片。原始放大倍数,200×(顶部面板)和400×(底部面板)

表1

非小细胞肺癌患者(n=149)中临床和遗传因素与程序性细胞死亡配体1(PD‐L1)表达的相关性

变量总计PD‐L1,n(%) P(P)‐价值
积极的否定
年龄,年
≤606124 (39.3)37 (60.7)0.423
>608829 (33.0)59 (67.0)
性别
男性9635(36.5)61 (63.5)0.761
女性5318 (34.0)35 (66.0)
吸烟状况
吸烟者5423 (42.5)31 (57.5)0.177
非吸烟者9530 (31.6)65 (68.4)
病理
模数转换器7625 (32.9)51 (67.1)
合同专用条款7328 (38.4)45 (61.6)0.486
TNM阶段
143 (21.4)11(78.6)0.529
国际投资协会6321 (33.3)42 (66.7)
IIb公司5923 (39.0)36 (61)
136 (46.1)7 (53.9)
淋巴结转移
积极的7229 (40.3)43 (59.7)0.246
否定7724 (31.2)53 (68.8)
表皮生长因子受体地位b条
野生型9629 (30.2)67 (69.8)0.041
突变的4622 (47.8)24 (52.2)
p‐IκBα表达
积极的5423 (42.6)31(57.4)0.177
否定9530 (31.6)65 (68.4)
HIF‐1α表达
积极的6427 (42.2)37 (57.8)0.143
否定8526 (30.6)59 (69.4)
p‐IκBα和HIF‐1α的表达
积极的c(c) 9040 (44.4)50 (55.6)0.005
否定 5913 (22.0)46 (78.0)
双侧χ2测试。
b条一些患者没有信息。
c(c)磷酸化(p‐)IκBα或缺氧诱导因子-1α(HIF‐1α)阳性。
p‐IκBα和HIF‐1α均为阴性。

ADC,腺癌;表皮生长因子受体;鳞状细胞癌。

在携带表皮生长因子受体与WT组织相比的突变体表皮生长因子受体基因(56.0%对44.0%,P(P)= 0.029和56.4%对43.6%,P(P)= .012;2). 此外,HIF‐1α阳性表达的NSCLC组织中p‐IκBα阳性表达组织的比例显著高于HIF-1α阴性表达的组织(59.2%vs 40.8%;P(P)= .002),如表所示.

表2

非小细胞肺癌患者(n=142)中表皮生长因子受体(EGFR)状态与磷酸化(p‐)IκBα或缺氧诱导因子-1α(HIF‐1α)表达的关系

变量总计EGFR状态(%) P(P)‐价值b条
重量突变的
p‐IκBα表达
积极的5028 (56.0)22 (44.0)
否定9268 (73.9)24(26.1)0.029
HIF‐1α表达
积极的6235 (56.4)27 (43.6)
否定8061 (76.2)19 (23.8)0.012
一些患者没有信息。
b条双侧χ2测试。

表3

非小细胞肺癌患者磷酸化(p‐)IκBα表达与缺氧诱导因子1α(HIF‐1α)表达的相关性(n=149)

变量总计HIF‐1α表达(%) P(P)‐价值
积极的否定
p‐IκBα表达
积极的5432 (59.2)22 (40.8)
否定9532 (33.6)63(66.4)0.002
双侧χ2测试。

4讨论

PD‐L1的过度表达已在包括非小细胞肺癌在内的各种人类肿瘤中检测到,并被报告为总体生存率的不良预后指标和对新免疫治疗药物良好反应的预测标志。27,28一些驱动基因突变包括表皮生长因子受体据报道,其参与了包括非小细胞肺癌在内的各种肿瘤中PD-L1表达的内在调节。29表皮生长因子受体是受体酪氨酸激酶ErbB家族的成员。表皮生长因子受体突变体通过组成性激活下游信号效应器,包括PI3K/AKT、RAS/ERK等,促进非小细胞肺癌的肿瘤发生。30,31活化AKT是EGFR通路的一个关键下游效应器,据报道可激活NF‐κB,从而调节PD‐L1的表达。32作为一种重要的转录因子,NF‐κB通过直接与PD-L1启动子结合来反式激活PD-L1的表达。33,34NF‐κB在未刺激细胞的细胞质中被IκB结合和抑制。在刺激后,IκB被上游IKK激酶磷酸化,NF‐κB释放并转位到细胞核转录靶基因,包括PD‐L1。通过磷酸化IKK激酶,进而磷酸化IκBα,激活PI3K/AKT可以进一步激活NF‐κB。35,36,37

在本研究中,我们研究了8个人类NSCLC细胞系中EGFR状态和EGFR信号通路激活与PD-L1表达的关系。基因分型和western blot结果表明,EGFR状态和EGFR表达共同影响NSCLC细胞ERK1/2、AKT和IκBα的磷酸化激活以及HIF-1α和PD-L1的表达。值得注意的是,在大多数被检测的NSCLC细胞中,PD-L1的表达与p-IκBα和HIF-1α的蛋白水平密切相关。进一步流式细胞术分析表明,NSCLC细胞发生突变表皮生长因子受体与携带WT的其余NSCLC细胞系相比,细胞表面EGFR和PD‐L1阳性的细胞百分比明显更高表皮生长因子受体另一个重要的转录因子HIF‐1α通过直接与PD‐L1启动子中的缺氧反应元件结合,增加缺氧癌细胞中PD‐L 1的表达。38,39缺氧时氧依赖性降解减少导致HIF‐1α表达上调,导致肿瘤血管生成、转移/迁移、葡萄糖代谢、细胞增殖、化疗抵抗和免疫适应相关基因的表达。40,41,42除了缺氧外,肿瘤中的基因改变和重要信号通路的异常激活也可以在正常氧条件下诱导HIF‐1α的表达。VHL(甚高频),PTEN公司,BRAF公司,以及SDH公司据报道,基因突变可调节常压下HIF‐1α的表达。40,43AKT的激活通过下游成分mTOR/S6上调HIF‐1α蛋白的翻译。44

我们的测序结果显示表皮生长因子受体H1975细胞和WT中的(L858R+T790M)突变表皮生长因子受体在H661和H1299细胞中,这3个细胞系用于研究EGFR在NSCLC细胞中调节PD‐L1表达的精确分子机制。转染4种常见基因的H661细胞表皮生长因子受体带有si-EGFR的突变或H1975细胞分别显示出明显上调或下调p-ERK、p-AKT、p-IκBα、HIF-1α和PD-L1的蛋白水平。相反,转染WT的H661细胞表皮生长因子受体或含有si-EGFR的H1299细胞在上述蛋白质水平上表现出相对轻微的变化。我们进一步用5种途径抑制剂(U0126、LY294002、雷帕霉素、BAY11‐7082和PX‐478)处理H1975细胞,以探讨EGFR途径的关键信号效应器在调节NSCLC细胞中PD‐L1表达中的潜在作用。Western blot分析显示,在所有5种抑制剂处理的H1975细胞中,p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1的蛋白水平受到显著抑制,其中BAY11‐7082和PX‐478表现出最强的抑制作用。这些结果表明p-AKT和p-ERK的重要作用,以及NF‐κB和HIF‐1α之间的潜在相互作用和合作,在PD-L1表达的调节中表皮生长因子受体NSCLC细胞中的突变体。据报道,活化的NF‐κB可以直接与HIF‐1α的启动子结合,并在缺氧或常压条件下促进包括癌细胞在内的多个细胞中的HIF­1α转录。45,46值得注意的是,一些研究揭示了HIF‐1α和NF‐κB通路之间的正反馈回路。缺氧诱导因子-1α可以通过IKKβ基因启动子中的缺氧反应元件诱导IKKβ的转录,并介导随后的核转位和NF-κB的激活。47缺氧诱导因子-1α也被报道在缺氧条件下直接转录NF‐κB的表达。45,48基于先前的研究报告和我们现有的研究结果,我们开发了一种可能的PD-L1表达调控模型表皮生长因子受体突变体(图5).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为CAS-110-1665-g005.jpg

程序性细胞死亡配体1流程图(PD公司‐L1)表皮生长因子受体的表达调节(表皮生长因子受体)通过下游信号效应器磷酸化的突变体(p‐)阿克特,第页ERK公司,核因子‐κB(法国试验标准‐κB)和缺氧诱导因子‐1α(高强度聚焦‐1α). IKK,IκB激酶

接下来,我们确定了关键EGFR信号效应器在非小细胞肺癌体内PD-L1表达调控中的作用。建立了携带H1975细胞的异种移植瘤小鼠模型,并用相应的通路抑制剂进行治疗。随后的western blot和免疫组织化学分析表明,所有抑制剂组的p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1的蛋白水平均不同程度地显著下调,PX‐478和BAY11‐7082治疗对PD‐L 1表达的抑制作用最强。这些结果与我们的体外研究结果一致,并进一步表明HIF‐1α和p‐IκBα在PD-L1表达调控中的重要作用表皮生长因子受体非小细胞肺癌的突变体。

调查表皮生长因子受体突变体、关键EGFR信号效应器和PD‐L1表达,我们进一步检测了149例人类非小细胞肺癌组织中的EGFR状态和p‐IκBα、HIF‐1α及PD‐L 1的蛋白水平。的突变率表皮生长因子受体该基因在非小细胞肺癌患者组中占32.4%,非小细胞癌组织携带表皮生长因子受体与WT组织相比,突变体显示PD-L1、p-IκBα和HIF-1α的蛋白水平升高表皮生长因子受体(P(P)= .041、.029和.012),这得到了之前各种报告的支持,即PD‐L1表达在NSCLC组织中上调表皮生长因子受体突变。21,49,50接下来,我们对HIF‐1α和p‐IκBα阳性染色与PD‐L1表达进行了关联分析,结果表明,与HIF-1α和p‐IκBα(P(P)= .005)。此外,观察到HIF-1α的蛋白表达与IκBα的磷酸化水平之间存在高度相关性(P(P)= .002). 这些统计分析结果表明表皮生长因子受体NSCLC组织中的突变体、p‐IκBα、HIF‐1α和PD‐L1蛋白水平。相反,其他一些回顾性研究报告显示,PD-L1阳性在携带WT的NSCLC组织中更为常见表皮生长因子受体和其他研究表明,PD-L1表达与表皮生长因子受体突变。51,52,53这些研究之间的差异可能是由异质性研究人群和PD-L1表达的变量定义引起的。此外,我们目前的研究结果表明,在研究PD-L1表达调控时,有必要探讨遗传和环境因素对NF‐κB和HIF‐1α的影响表皮生长因子受体突变体。值得注意的是,最近的一些临床试验和回顾性研究表明,PD-1/PD-L1抑制策略在表皮生长因子受体突变NSCLC与WT的比较表皮生长因子受体.54,55这种缺乏反应可能部分归因于表皮生长因子受体PD-L1表达突变和EGFR通路激活引起的肿瘤浸润淋巴细胞抑制,这可能与未燃烧的肿瘤微环境和免疫抑制有关。56,57

综上所述,我们的数据表明p-AKT、p-ERK、NF-κB和HIF-1α在PD-L1表达调控中的重要作用,以及NFκB与HIF‐1α之间的潜在相互作用和合作表皮生长因子受体NSCLC细胞中的突变体。考虑到实体肿瘤中普遍存在缺氧及其对HIF‐1α表达的诱导作用,驾驶突变结合缺氧条件对PD‐L1表达调节和肿瘤免疫逃逸的影响值得在扩大的NSCLC病例中进一步研究。

利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金重点项目(81630071和81330062)的支持;国家重点研发项目精准医学专项研究(2016YFC0902300);国家863计划(SS2015AA020403);北京市自然科学基金项目(7152029和7172045);癌症医学协同创新中心;北京大学-清华大学生命科学联合中心临床研究员;CAMS医学科学创新基金(批准号:CIFMS 2016-I2M-3-008);和国家自然科学基金会(批准号81101778;81472206)。本研究得到北京肿瘤医院伦理和学术委员会的批准,并获得了每个受试者的知情同意。

笔记

郭锐,李毅,王Z,等。缺氧诱导因子-1α和核因子‐κB在表皮生长因子受体突变体调控非小细胞肺癌细胞程序性死亡配体1表达中发挥重要作用.癌症科学. 2019;110:1665–1675. 10.1111/卡斯.13989[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

资金筹措信息

北京市自然科学基金,批准/奖励号7152029,7172045;国家重点研发项目精准医学专项研究,批准/奖励号2016YFC0902300;国家自然科学基金,授予/奖励号81101778,81472206;CAMS医学科学创新基金,授予/奖励号:CIFMS 2016‐I2M‐3‐008;国家自然科学基金重点项目,授予/奖励号81330062,81630071;国家高技术研究开发计划863,批准/奖励号SS2015AA020403

参考文献

1Siegel R、De Santis C、Virgo K等人。2012年癌症治疗和生存统计.临床医师肿瘤杂志. 2012;62:220‐241. [公共医学][谷歌学者]
2Kocher F、Hilbe W、Seeber A等人。2293例非小细胞肺癌患者的纵向分析:来自TYROL登记的综合研究.肺癌. 2015;87:193‐200. [公共医学][谷歌学者]
三。Korpanty GJ、Graham DM、Vincent MD等。目前影响肺癌临床实践的生物标记物:EGFR、ALK、MET、ROS‐1和KRAS.前Oncol. 2014;4:204.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Dienstmann R、Rodon J、Prat A等。FGFR途径中的基因组畸变:实体肿瘤靶向治疗的机会.肿瘤学年鉴. 2014;25:552‐563.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Brahmer JR、Tykodi SS、Chow LQ等人。晚期癌症患者抗PD‐L1抗体的安全性和活性.N英格兰J医学. 2012;366:2455‐2465.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Topalian SL、Hodi FS、Brahmer JR等。癌症中抗-PD-1抗体的安全性、活性和免疫相关性.N英格兰J医学. 2012;366:2443‐2454.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Okazaki T、Honjo T。PD-1和PD-1配体:从发现到临床应用.国际免疫学. 2007;19:813‐824. [公共医学][谷歌学者]
8邹伟(Zou W)、沃尔乔克(Wolchok)、JD、陈雷(Chen L.)。PD-L1(B7-H1)和PD-1通路阻断用于癌症治疗:机制、反应生物标记物和组合.科学转化医学. 2016;8:328rv4。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9石磊,陈S,杨磊,等。PD-1和PD-L1在血液恶性肿瘤患者T细胞免疫抑制中的作用.血液肿瘤杂志. 2013;6:74.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Sanmamed MF,Chen L。B7‐H1(PD‐L1)的诱导表达及其在肿瘤部位免疫调节中的选择性作用.癌症J. 2014;20:256‐261.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11范毅,马凯,王C,等。肺神经内分泌肿瘤中PD‐L1和PD‐1表达的预后价值.Onco目标Ther. 2016;9:6075‐6082.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Takada K、Okamoto T、Shoji F等。原发性肺腺癌手术切除后PD-L1蛋白表达的临床意义.胸部肿瘤学杂志. 2016;11:1879‐1890. [公共医学][谷歌学者]
13吴平,吴丁,李磊,等。PD‐L1与实体瘤生存率的荟萃分析.公共科学图书馆一号. 2015;10:e0131403。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Ritprajak P,Azuma M。免疫调节分子PD-L1在上皮细胞和鳞状细胞癌中表达的内在和外在控制.口腔癌. 2015;51:221‐228. [公共医学][谷歌学者]
15Liu J、Hamrouni A、Wolowiec D等。多发性骨髓瘤患者的浆细胞表达B7‐H1(PD‐L1),并通过MyD88‐、TRAF6‐和MEK依赖性途径用IFN‐{γ}和TLR配体刺激后增加表达.血液. 2007;110:296‐304. [公共医学][谷歌学者]
16陈杰,冯毅,卢力,等。干扰素γ通过PKD2信号通路诱导人口腔鳞癌PD-L1表面表达.免疫生物学. 2012;217:385‐393. [公共医学][谷歌学者]
17Marzec M、Zhang Q、Goradia A等。癌基因激酶NPM/ALK通过免疫抑制蛋白CD274(PD-L1,B7-H1)的STAT3表达诱导.《美国科学院院刊》. 2008;105:20852‐20857.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Xu C、Fillmore CM、Koyama S等。Lkb1和Pten缺失导致肺鳞癌,PD-L1表达升高.癌细胞. 2014;25:590‐604.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Dearden S、Stevens J、Wu YL等。非小细胞肺癌的突变发生率和巧合:按种族和组织学的荟萃分析(mutMap).肿瘤学年鉴. 2013;24:2371‐2376.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Akbay EA、Koyama S、Carretro J等人。激活PD‐1通路有助于EGFR驱动的肺肿瘤的免疫逃逸.癌症迪斯科. 2013;:1355-1363。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21D'Incecco A、Andreozzi M、Ludovini V等。分子选择的非小细胞肺癌患者中PD-1和PD-L1的表达.英国癌症杂志. 2015;112:95‐102.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Wichmann H、Güttler A、Bache M等人。用治疗性抗体和siRNA靶向EGFR和HER2:胶质母细胞瘤细胞的比较研究.斯特拉伦特·昂科尔. 2015;2:180‐191. [公共医学][谷歌学者]
23陈恩,方伟,林姿,等。KRAS突变诱导的PD-L1上调介导人肺腺癌的免疫逃逸.癌症免疫疗法. 2017;9:1175‐1187.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Kakudo N、Morimoto N、Ogawa T等人。低氧通过HIF‐1á激活促进人类脂肪源性干细胞的增殖.公共科学图书馆一号. 2015;10:e0139890。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Chang YL、Yang CY、Lin MW等。PD-L1和HIF-1α的高共表达与肺多形性癌肿瘤坏死相关.欧洲癌症杂志. 2016;60:125‐135. [公共医学][谷歌学者]
26Giaccone G、Gallegos Ruiz M、Le Chevalier T等人。埃洛替尼一线治疗晚期非小细胞肺癌:一项II期研究.临床癌症研究2006年;12:6049‐6055. [公共医学][谷歌学者]
27马伟,吉利根·BM,袁J,等。PD‐1/PD‐L1免疫检查点阻断疗法翻译生物标记物研究现状与展望.血液肿瘤杂志. 2016;9:47.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Goel G、Sun W。胃肠道肿瘤治疗进展——免疫检查点阻断的新作用.血液肿瘤杂志. 2015;8:86.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29张伟,庞Q,张欣,等。程序性死亡配体1是食管鳞癌的预后因子,与表皮生长因子受体相关.癌症科学. 2017;108:590‐597.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Akca H、Tani M、Hishida T等人。突变型EGFR激活AKT和STAT3通路并延长人肺癌细胞的生存期.肺癌2006年;54:25‐33. [公共医学][谷歌学者]
31Sordella R、Bell DW、Haber DA等人。吉非替尼致敏肺癌EGFR突变激活抗凋亡途径.科学类2004年;305:1163-1167。[公共医学][谷歌学者]
32林坤,程杰,杨涛,等。EGFR‐TKI通过抑制NF‐κB下调EGFR突变体NSCLC中的PD‐L1.生物化学-生物物理研究委员会. 2015;463:95‐101. [公共医学][谷歌学者]
33Xiong HY、Ma TT、Wu BT等人。IL‐12通过对NF‐κB信号的影响调节卵巢癌相关巨噬细胞中B7‐H1的表达.亚太癌症预防杂志. 2014;15:5767‐5772. [公共医学][谷歌学者]
34黄G,文Q,赵毅,等。NF‐κB在脂多糖治疗后诱导人单核细胞CD274表达中起关键作用.公共科学图书馆一号. 2013;8:e61602。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35戈什·S,达斯·JF。NF‐κB通过泛素化或磷酸化导致其活化的通路串扰相互作用研究:简要综述.基因. 2016;584:97‐109. [公共医学][谷歌学者]
36Vallabhapurapu S,Karin M。NF-kappaB转录因子在免疫系统中的调节和功能.Annu Rev Immunol公司2009年;27:693‐733. [公共医学][谷歌学者]
37Aggarwal BB、Takada Y、Oommen OV。从化学预防到化学治疗:共同目标和共同目标.投资药物专家2004年;13:1327‐1338. [公共医学][谷歌学者]
38Barsoum IB、Smallwood CA、Siemens DR等。癌细胞缺氧介导的适应性免疫逃逸机制.癌症研究. 2014;74:665‐674. [公共医学][谷歌学者]
39Noman MZ、Desantis G、Janji B等人。PD‐L1是HIF‐1α的一个新的直接靶点,其在缺氧条件下被阻断可增强MDSC介导的T细胞活化.实验医学杂志. 2014;211:781‐790.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40塞门扎GL。HIF‐1癌症治疗抑制剂:从基因表达到药物发现.当前药物设计2009年;15:3839‐3843. [公共医学][谷歌学者]
41Lee YH、Bae HC、Noh KH等。癌症患者常氧下HIF‐1α的增加通过AKT/ERK和VEGFA轴介导免疫适应.临床癌症研究. 2015;21:1438‐1446.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42邹杰,李鹏,陆峰,等。Notch1是缺氧诱导T细胞急性淋巴细胞白血病细胞增殖、侵袭和耐药所必需的.血液肿瘤杂志. 2013;6:3.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Masoud GN、Li W。HIF‐1α途径:癌症治疗的作用、调节和干预.药物学报B. 2015;5:378‐389.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44姜博华,姜刚,郑JZ,等。磷脂酰肌醇3激酶信号传导控制缺氧诱导因子1的水平.细胞生长不同. 2001;12:363‐369. [公共医学][谷歌学者]
45姜瑜、朱瑜、王旭等。缺氧性肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的时间调控.Oncotarget公司. 2015;6:9409‐9419.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46Yao G,Zhang Q,Doeppner TR,等。低密度脂蛋白通过NF‐κB抑制阻断HIF通路抑制血管生成,而蛋白酶体抑制剂BSc2118可逆转这种抑制.Oncotarget公司. 2015;6:30251‐30262.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47Mak P、Li J、Samanta S等。前列腺癌NF‐κB活化的ERβ调控由HIF‐1介导.Oncotarget公司. 2015;6:40247‐40254.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48Walmsley SR、Print C、Farahi N等。缺氧诱导的中性粒细胞存活由HIF‐1α依赖性NF‐kappaB活性介导.实验医学杂志. 2005;201:105‐115.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49Azuma K、Ota K、Kawahara A等人。手术切除的非小细胞肺癌中PD-L1过度表达与激活EGFR突变的关系.肿瘤学年鉴. 2014;25:1935‐1940. [公共医学][谷歌学者]
50宋泽,余X,程G,等。手术切除肺腺癌中与分子特征相关的程序性死亡配体1表达.转化医学杂志. 2016;14:188。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Cha YJ、Kim HR、Lee CY等。肺腺癌中程序性细胞死亡配体-1的表达及其与p53状态的关系.肺癌. 2016;97:73‐80. [公共医学][谷歌学者]
52Yoneshima Y、Ijichi K、Anai S等。含有EGFR突变或ALK重排的肺腺癌中PD‐L1的表达.肺癌2018年;118:36‐40. [公共医学][谷歌学者]
53Cooper WA、Tran T、Vilain RE等人。PD-L1表达是早期非小细胞癌的良好预后因素.肺癌. 2015;89:181‐188. [公共医学][谷歌学者]
54Gainor JF、Shaw AT、Sequist LV等人。EGFR突变和ALK重排与非小细胞肺癌对PD-1通路阻断的低反应率相关:一项回顾性分析.临床癌症研究. 2016;22:4585‐4593.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
55Rittmeyer A、Barlesi F、Waterkamp D等人。阿托利珠单抗与多西紫杉醇在先前治疗过的非小细胞肺癌(OAK)患者中的比较:一项3期、开放标签、多中心随机对照试验.柳叶刀. 2017;389:255‐265.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
56王S、张毅、王毅等。双调节蛋白通过EGFR/GSK‐3β/Foxp3轴赋予调节性T细胞抑制功能和肿瘤侵袭.生物化学杂志. 2016;291:21085‐21095.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
57于S,刘德,沈B,等。EGFR突变型肺癌的免疫治疗策略.美国癌症研究杂志2018年;8:2106‐2115。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

文章来自癌症科学由以下人员提供布莱克威尔