胆固醇硫转移酶SULT2B1b调节去势耐药前列腺癌对死亡受体配体TNF-α的敏感性

抗体和试剂

针对以下蛋白质的主要抗体用于这些研究：TNFα（Thermo，P300A）和TRAIL/TNFSF10（R&D Systems，MAB375）用于中和；β-actin（Cell Signaling，3700）、phospho-IkB（Cell信号，9246）、IkBα（Cell信令，4814）、TRADD（BD，610572）和SULT2B1（Abcam，ab88085）用于蛋白质印迹；以及用于流式细胞术的TNFR1（Abcam，ab19139）和TNFR2（Abcam，ab109322）。次级抗体包括用于免疫印迹的山羊抗鼠IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2005）和用于流式细胞术的驴抗兔IgG-AlexaFluor647（Biolegend，406414）。

使用控制/非靶向siRNA复合物（Dharmacon）和siRNA靶向完成RNAi研究SULT2B1系列（IDT，HSC.RNAI.N004605.12.2），TNF公司（IDT，hs.Ri.TNF.13.2），TL1（IDT、hs.Ri.TNFSF15.13.3），或DAXX公司（IDT，hs.Ri.DAXX.13.1）根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMax（ThermoFisher）。如前所述完成RNA分离和cDNA合成(17)，源自EZNA Total RNA Kit I（Omega Bio-tek）。用于这些研究的PrimeTime®qRT-PCR基因探针（IDT）包括：AR公司（Hs.PT.56a.38770693），KLK3号机组（PSA）（Hs.PT.56a.38546086），SULT2B1系列（Hs.PT.56a.25562421.g），TNF公司（Hs.PT.58.45380900），以及SULT2B1b型（Hs.PT.58.22608626）。

此外，用于细胞裂解物的重组人TNFα（Peprotech，300–01A）、人TRADD细胞ELISA试剂盒（Abnova，KA3564）和人TNF-αELISA试剂瓶（Sigma-Aldrich，RAB1089）也用于这些研究。按照制造商的说明使用TRADD ELISA试剂盒，方法是在siRNA转染72小时后固定粘附细胞，并将其归一化为结晶紫吸光度，而TNFαELISA则分别使用在LNCaP和C4-2细胞中siRNA转导72小时或96小时后样品中的细胞裂解物进行。为了评估细胞活力，根据制造商的说明，在这些研究中使用了细胞计数试剂盒-8（Dojindo Molecular Technologies，Inc.）。

萤光素酶检测

通过转染pNF-κB-荧光素酶报告质粒（Stratagene）和雷尼利亚使用FuGENE HD转染试剂（Promega，E2311）的荧光素酶质粒（pRL-TK），然后使用双荧光素素酶报告试剂盒（Promeca，E1910）评估荧光素酶活性。(18)相对荧光素酶活性（RLU=萤火虫/雷尼利亚)NF-κB报告子结构的平均值显示为至少三个独立实验（一式三份）的折叠变化（在没有siRNA转染的样品上）+/-SEM的平均值。有关更多详细信息，请参阅补充方法.

流式细胞术

对于细胞周期分析，根据制造商的说明，用碘化丙啶（Biolegend#421301）对固定细胞进行染色，并在FACSCanto II（BD Biosciences）上进行分析。使用FlowJo软件版本9（TreeStar Inc.）对DNA含量进行进一步分析。对于蛋白质表达分析，在BD Fortessa LSR（BD Biosciences）上对细胞进行分析，并使用FlowJo软件将实验样品的平均荧光强度（MFI）与二级对照样品进行比较。

细胞制备和装入C1系统

siRNA转染48小时后，用胰蛋白酶采集LNCaP细胞，并用僵尸紫活性染料（Biolegend，423114）染色，然后在FACS ARIA III（BD Biosciences）上分选活细胞。细胞在17–25µm IFC板（Fluidigm，100–5761）中加载并染色，然后排除含有双重细胞或死细胞的捕获位点。对对照组和SULT2B1b KD细胞连续几天完成该程序，并对生物复制重复三次。总共使用209个对照siRNA和190个SULT2B1b siRNA处理的细胞进行分析。有关C1加载和后续库准备的更多详细信息，请参阅补充方法.

cDNA采集、定量、文库制备和测序

使用带有dsDNA HS分析试剂盒（Life Technologies，{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q32851”，“term_id”：“75280859”，“term_text”：“QA2851”}}问题32851)并归一化为0.1–0.3 ng/µL的浓度，用于文库制备。使用Nextera®XT DNA样品制备试剂盒和索引试剂盒（Illumina，FC-131-1096和FC-131-1002）制备文库，然后根据Fluidgm C1 mRNA测序协议进行量化。在快速运行模式下，使用HiSeq 2500系统（Illumina）对未经训练的2×100bp读数进行测序。进行了三次单独的测序运行，每一次都在一条通道中使用共用的对照KD细胞库，在另一条通道上使用共用的SULT2B1b KD细胞图书馆。添加了cBot Duo（Illumina），以便在单个快速流动细胞中添加不同的样品池。

序列修剪和对齐

通过FastX-Toolkit版本0.0.13.2对序列进行质量调整并删除适配器(19). 使用了30的FastX修剪分数和50的修剪长度。最大长度设置为151个底座。FastQC版本0.11.2(20)运行以检查质量修整和适配器移除前后的数据质量。

使用Tophat2将读数与合集基因组参考联盟人类构建38（GRCh38.p3）一致(21,22)Tophat2 2.1.0版本使用默认设置运行，但有两个例外：一个不匹配是允许的，并且由于测序库的非链特异性，库类型设置为“fr unstranded”。HTSeq v.0.6.1(23)在“intersection-nonempty”模式下用于计算映射到特征的读取数；本分析中使用了Biopython v.2.7.3。

统计分析和路径分析

的统计分析在体外学生使用的研究t吨-使用GraphPad Prism 5软件进行方差测试或分析（ANOVA），根据需要进行或不进行多重比较测试。统计显著值用数字表示，如*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001或****p<0.0001（无显著性以n.s.表示）。所有scRNA-seq数据都可以在GEO中获得，并带有登录号{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE117410”，“term_id”：“117410”}}GSE117410共对36135个基因进行了测序，其中许多基因表现出低表达水平。移除所有样本中平均计数小于5的基因，然后使用Bioconder R软件包测试差异表达边缘R第3.2.2节，。使用Benjamini-Hochberg程序控制5%的错误发现率（FDR），获得2029个差异表达（DE）基因。DE基因、FDR、log（fold-change）和log（counts per million）被上传到Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件（Qiagen），并进行了典型通路分析和上游调节器分析。根据输入的DE基因在IPA中预测上游调控因子，并使用单侧Fisher精确检验确定p值。

NF-κB活化由SULT2B1b KD处理的LNCaP细胞内的TNF表达诱导。

作为死亡受体信号的贡献者和参与者，在scRNA-seq数据集中研究了TNF和NF-κB。TNF和NF-κB复合物均被预测激活（z-score=4.552，p=1.68E-08和z-score=4.383，p=2.75E-06）许多DE基因的上游调控因子。此外，四个TNF诱导的NF-κB调节基因在SULT2B1b KD细胞中显著上调，包括MnSOD、A20、cIAP2和Bcl-XL(图2). 利用LNCaP和C4-2细胞进行了进一步的研究，以验证SULT2B1b对该途径的调节。LNCaP细胞中SULT2B1b KD诱导TNF公司NF-κB的表达和激活，支持scRNA-seq数据(图3A-D). 在患有SULT2B1b KD的LNCaP细胞中，TNF蛋白的表达没有显著升高，但与对照KD细胞相比，其表达有上升趋势(图3B). 在携带SULT2B1b KD的C4-2细胞中，TNF表达和NF-κB活性均未显著增加，但SULT2B1 B KD确实激活了IκB的磷酸化(图3A-D).

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图2。

预计SULT2B1b KD可激活scRNA-seq中的TNF和NF-κB。

紫罗兰图表示对照KD中指定NF-κB靶基因的表达（读取计数）与SULT2B1b KD组的scRNA-seq分析，调整后的p值显示在左上角。

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图3。

SULT2B1b KD诱导LNCaP中TNF表达并激活NF-κB，但不激活C4-2细胞。

用对照或SULT2B1b siRNA转染LNCaP和C4-2细胞，并评估（A-B）TNF表达或（C-D）NF-κB活性。（A） qRT-PCR用于TNF公司siRNA KD后72小时表达。（B） siRNA KD后72小时，用基于细胞裂解物的ELISA定量TNF蛋白表达。（C） 荧光素酶检测在siRNA转染48小时后完成。NF-κB荧光素酶活性标准化为雷尼利亚荧光素酶。样品进一步标准化，以控制孔，无siRNA转染。横线表示使用Student t检验的至少四个独立实验的平均+/-SEM。（D） siRNA KD后72小时对指示蛋白进行Western blot。

为了确定SULT2B1b KD激活NF-κB是否是由于在LNCaP细胞中诱导TNF表达所致，对SULT2B1 B KD细胞中的TNF进行连续KD。这些数据表明，通过荧光素酶分析，SULT2B1b KD细胞中TNF表达的缺失消除了NF-κB活性的诱导(图4A-B). 了解到LNCaP细胞对TNF介导的细胞死亡敏感图3和​和4B4B类质疑SULT2B1b KD产生的TNF是否是这些细胞凋亡的原因。TNF中和实验是为了解决这个问题；这些研究表明，通过分析亚G1期细胞核，SULT2B1b-KD细胞中基于抗体的TNF中和作用对细胞死亡没有影响，而外源性TNF可以在这些细胞中有效中和(图4C). 因此，LNCaP细胞中的SULT2B1b KD产生TNF，导致NF-κB活化，但这些细胞中的TNF中和不能阻止SULT2B1 B KD诱导的凋亡。

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图4。

SULT2B1b KD细胞中TNF的表达是NF-κB活化的原因，但不诱导细胞死亡。

（A） pRT-PCR指示SULT2B1b系列和TNF公司连续转染SULT2B1b siRNA和TNF siRNA的LNCaP细胞中的表达。通过单因素方差分析和多重比较试验确定显著性。（B） NF-κB荧光素酶检测在siRNA转染48小时后完成，并显示相对荧光素酶单位（RLU）。条形图表示仅考虑对照KD和SULT2B1b KD组的双向方差分析得出的至少三份样品的平均+/-SEM，该图代表两个独立实验。（C） 用TNF中和抗体（40µg/mL）预处理LNCaP细胞，然后用对照或SULT2B1b siRNA转染或用指定浓度的外源性TNFα处理。在siRNA转染后约72小时，收获细胞并制备用于通过流式细胞术进行细胞周期分析。条形图表示三份样品的平均G1亚核+/-SEM百分比。该图代表了至少两个独立的实验。

SULT2B1b的表达改变了LNCaP和C4-2细胞对TNF介导的细胞死亡的敏感性。

虽然SULT2B1b KD通过TNF的表达激活NF-κB，但这似乎不是这些细胞凋亡的直接机制(图3——4). 数据显示于图3也证明SULT2B1b KD对LNCaP和C4-2细胞系中TNF表达和NF-κB活性有不同的影响。我们假设与死亡受体信号相关的基因上调会使SULT2B1b KD细胞对死亡配体刺激敏感。对SULT2B1b KD在LNCaP和C4–2细胞中的影响的进一步研究表明，SULT2B1b KD在二者都通过细胞周期分析确定LNCaP和C4-2细胞与对照组的比较(图5A-B). 当增加TNF浓度时，在两种细胞系的SULT2B1b KD细胞中也可以看到细胞死亡增强的剂量反应(图5A-B).

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图5。

SULT2B1b调节LNCaP和C4-2细胞对TNF介导的细胞死亡的敏感性。

在添加指定浓度的TNF之前，用对照或SULT2B1b siRNA转染LNCaP（A）或C4-2（B）细胞。72小时后收集所有细胞，并通过流式细胞仪进行细胞周期分析。条形图表示三次孔的亚G1细胞核+/−SEM的平均百分比。对于（A）和（B）中的所有TNF处理细胞，通过双向方差分析，SULT2B1b KD显著提高LNCaP和C4-2细胞中G1以下细胞核的百分比（p<0.0001）。图是三个独立实验的代表。通过（C）qRT-PCR和（D）western blot评估LNCaP-SULT2B1b细胞中（C-D）SULT2B1b的表达。（E） 在添加指定浓度的TNF之前，用强力霉素处理LNCaP-SULT2B1b细胞。72小时后，收集所有细胞并通过流式细胞仪进行细胞周期分析。条形图表示通过双向方差分析和多重比较测试评估的三个孔的%亚G1核+/-SEM平均值。该图代表重复实验。

根据我们之前的报告，SULT2B1b KD降低了LNCaP细胞中AR的表达和活性，我们旨在确定TNF对LNCaP或C4-2细胞中SULT2Bb KD细胞的治疗是否会加剧AR活性的影响。在患有SULT2B1b KD的LNCaP细胞中，低剂量TNF处理导致SULT2B1 bKD和TNF处理在减少两者之间的显著交互作用AR公司（p=0.0361）和PSA（p=0.0421）表达，而通过双向方差分析，在C4-2细胞中SULT2B1b KD和TNF处理之间没有显著的相互作用(补充图3). 然而，与对照KD细胞相比，经SULT2B1b KD和TNF处理的C4-2细胞显著降低了PSA表达(补充图3B). 因此，尽管TNF和SULT2B1b KD能够独立抑制AR活性(6,17)虽然分子间的相互作用只发生在LNCaP细胞中，而不发生在CRPC模型中，但这种结合导致AR活性的最大降低。

由于流式细胞术未观察到TNFR1或TNFR2的显著增加，因此对TNF诱导的凋亡的敏感性增强似乎不是由于TNF受体表达的改变(补充图4). 先前的报告表明，TNF受体相关衔接蛋白（TRADD）表达的缺失是晚期前列腺癌细胞（如C4-2）对TNF介导的细胞死亡敏感性降低的原因。(6)SULT2B1b KD中TRADD表达的Western blot和ELISA分析与对照KD细胞表明，SULT2B1b KD处理后LNCaP细胞中TRADD表达增加，但C4-2细胞中TRAND表达没有增加(补充图5). 因此，SULT2B1b可能调节TRADD水平，并可能解释LNCaP细胞对TNF敏感性的改变，但不能解释C4-2细胞对TNF-治疗敏感性的增强。

完成了额外的研究，以确定SULT2B1b KD介导的对TNF诱导的细胞死亡的敏感性增加是否仅仅是先前证明正在经历凋亡的细胞的伪影，或者SULT2B1 b是否是这种死亡受体途径的调节器。为了解决这个问题，通过添加多西环素，产生LNCaP-SULT2B1b细胞来诱导稳定的SULT2B1b过度表达。LNCaP-SULT2B1b的实验表明，SULT2B1b调节TNF介导的细胞死亡，因为与不诱导强力霉素相比，强力霉素的添加导致对外源性TNF治疗的敏感性显著降低(图5C-E). 这些研究证实了SULT2B1b作为前列腺癌细胞对TNF介导的细胞死亡敏感性的调节器的作用。

这些研究得到了国防部前列腺癌研究项目拨款#W81XWH-14–1-0588（TL Ratliff、AD Mesecar、SA Crist和RE Vickman）和沃尔特癌症基金会（TL Ratliff）的支持。作者感谢前列腺癌基金会的慷慨支持和DDC Medical对我们的细胞系进行认证。我们感谢普渡基因组核心设施（特别是菲利普·桑米格尔和保罗·帕克）、普渡流式细胞术和细胞分离设施、生物信息学共享资源、普渡大学癌症研究中心（NIH拨款P30 CA023168）、IU西蒙癌症中心（NIH-拨款P30 CA 082709，NA Lanman）、，以及沃尔瑟癌症基金会。我们也非常感谢Bennett Elzey博士和Ratliff实验室成员对该项目的持续建议和支持。