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实验医学。2019年3月;17(3): 1697–1705.
2018年12月19日在线发布。 数字对象标识:10.3892/等2018.7112
预防性维修识别码:PMC6364144型
PMID:30783438

miR-183下调抑制PANC-1胰腺癌细胞生长体外体内增加对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的化疗敏感性

关联数据

数据可用性声明

摘要

胰腺癌是一种常见的恶性肿瘤,其发病机制尚不清楚。目前,抗PC治疗的疗效不足,部分原因是癌细胞的化疗耐药性。本研究旨在阐明miR-183在人类PC细胞增殖、凋亡和对5-氟尿嘧啶和吉西他滨化疗敏感性中的作用及其相关机制。用microRNA(miR)-183抑制剂转染PANC-1细胞,通过MTT法评估miR-183对细胞增殖的影响。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布。体内在BALB/c裸鼠中建立PANC-1细胞的肿瘤异种移植模型,以检测miR-183下调对肿瘤生长的影响。此外,通过逆转录定量聚合酶链反应和western blotting在收集的细胞中检测了10号染色体(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物的组分。最后,用5-氟尿嘧啶或吉西他滨处理PANC-1细胞,并转染miR-183抑制剂,用MTT法测定细胞活力。结果表明,敲低miR-183可显著降低PANC-1细胞的增殖,促进其凋亡。转染miR-183抑制剂的细胞在G1相(P<0.01)。此外,miR-183下调导致PI3K、Akt和B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)表达的mRNA水平显著降低(P<0.001),PANC-1细胞中PTEN和Bcl-2相关X蛋白表达显著增加(P<0.0001)。敲除miR-183能够显著增加PANC-1细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的化疗敏感性。这些结果表明,下调miR-183可以抑制PC细胞的生长体外体内,并通过调节PTEN/PI3K/Akt信号通路增加细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的敏感性。

关键词:microRNA-183、10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物、化疗敏感性、胰腺癌

介绍

胰腺癌(PC)是一种常见的侵袭性恶性肿瘤,也是癌症相关死亡率的主要原因之一(1). 根据以前的报告,全球每年有超过227000人死于PC(2). 目前,PC的发病机制尚不清楚,预后仍然很差(5年生存率<2%)(). 吉西他滨和5-氟尿嘧啶是最常用的抗PC药物;然而,目前抗PC治疗的疗效仍不令人满意,部分原因是癌细胞的化疗耐药性(4). 先前的研究表明,遗传学可能通过激活癌基因和沉默抑癌基因在前列腺癌的发生中发挥重要作用(57). 因此,有必要确定可能作为潜在治疗靶点的与PC发病机制相关的关键分子。

近年来,人们对microRNA(miRNA或miRs)在癌症中的作用进行了深入的研究。miRNAs是一种小的非编码RNA(约22个核苷酸),可以与一个或多个靶基因的3′-非翻译区(UTR)结合并负调控这些基因的表达(8). 在PC患者的组织和血清样本以及PC细胞系中观察到miRNA的异常表达,这表明miRNA可能参与PC的发病机制(913).

据报道,miR-183在多种癌症中起重要作用。先前的研究表明,miR-183可能参与肿瘤发生和发展过程中的各种细胞和分子事件(1416). miR-183已被证明在人类乳腺癌、结直肠癌和食管癌中异常表达,miR-183作为肿瘤抑制因子或肿瘤miR的作用已在先前讨论过(1720). 此前的一项研究表明,miR-183在乳腺癌中过度表达,并通过促进癌细胞的增殖和转移参与癌症的发展过程(17); 相反,在宫颈癌中,miR-183被报道为一种抑癌剂,可以抑制癌细胞的侵袭和转移(21).

据报道,在PC中miR-183的表达上调(22); 然而,miR-183的生物学特性和靶点尚不清楚。在本研究中,探讨了miR-183在PC中的作用,特别关注了miR-183对人胰腺癌细胞系PANC-1中癌细胞增殖、凋亡以及对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的化学敏感性的影响。

材料和方法

细胞系

人类正常胰腺细胞系H6C7购自广州杰尼奥生物科技有限公司(中国广州),并在补充有10%胎牛血清(FBS)的角质形成细胞无血清培养基(Gibco;Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)中培养。人胰腺癌细胞系PANC-1购自上海美轩生物科技有限公司(中国上海),并在添加10%FBS的Dulbecco改良Eagle's培养基(Gibco;Thermo Fisher Scientific,Inc.)中培养。培养物保存在37°C、5%CO的增湿空气中2H6C7细胞用于测定正常胰腺细胞中miR-183的表达,PANC-1细胞用于所有其他实验。

细胞转染

miR-183抑制剂(5′-AGUGAAUUCUACCAGUCCAUA-3′)和抑制剂对照(5′-CAGUACUUUGUGUAGUACAA-3′)(22)从上海基因制药有限公司(中国上海)购买。使用脂质体进行转染®RNAiMAX转染试剂(Invitrogen;Thermo Fisher scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)符合制造商的说明。在37°C和5%CO孵育48小时后进行进一步分析2PANC-1细胞分为以下三组:未转染组(NC)、转染抑制剂对照组和转染miR-183抑制剂组。

细胞增殖试验

根据制造商的方案,在转染48小时后,使用MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(中国海门贝约泰生物技术研究所)测定细胞增殖。使用二甲基亚砜溶解细胞中的紫色甲霜,使用SynergyTM 2多功能微孔板分光光度计(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,VT,USA)在490 nm波长下测量。使用倒置显微镜(CKX31;Olympus Corporation,Tokyo,Japan;放大倍数,×100)拍摄MTT分析的代表性图像。

细胞凋亡

转染后48 h,使用Annexin V/碘化丙酸盐(PI)凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)对细胞进行染色。将细胞接种到6孔板(4×105细胞/孔)。转染后,收集细胞,用PBS清洗,并将其重新悬浮在500µl HEPES缓冲液中(Sigma-Aldrich;默克公司,德国达姆施塔特)。随后,将5µl Annexin V-FITC和5µl PI添加到缓冲液中,并在室温下黑暗培养15分钟。利用FACSVerse分析细胞凋亡率FACSCanto II FACP阵列流式细胞仪软件(版本3.0;BD Biosciences)。

细胞周期测定

使用细胞周期和细胞凋亡分析试剂盒(Beyotime生物技术研究所)进行细胞周期测定。细胞接种到6孔板(4×105细胞/孔)。转染后,收集细胞并用PBS清洗。随后,添加100µl RNase A溶液,然后在37°C下培养细胞30分钟。最后,添加400µl PI并在室温下培养30分钟。用FACSCanto II的FACSVerse™流式细胞仪检测DNA含量;FACP阵列软件(版本3.0;BD Biosciences)。

逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

使用TRIzol从细胞中分离出总RNA样本®试剂(Life Technologies;Thermo Fisher Scientific,Inc.)。miR-183的表达用Maxima定量®SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2X;Thermo Fisher Scientific,Inc.),U6作为内部控制。通过使用Revert Aid Fisher Scientific公司的第一链cDNA合成试剂盒进行RT,测定了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶B(Akt)、第十染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平以及根据制造商的方案使用StepOne™实时PCR系统(Applied Biosystems;Thermo Fisher Scientific,Inc.)进行qPCR分析。内部控制采用GAPDH。所用引物序列如下:miR-183,正向5′-CGGTATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′,反向5′-GCTTCCAATGCACTACT-3′;U6,正向5′-CTCGCTCGGCAGCACA-3′和反向5′-AACGCTCACGAATTTGCGT-3′;PI3K正向,5′-TATTGGACTTTGCGACAGACT-3′和反向,5′-TCGAACGTACTGGTCTCGATAG-3′;Akt正向,5′-TCCTCTCAATGATGGCA-3′和反向,5′-GTGCGTCGATGACAGTGGT-3′;PTEN正向,5′-TTTTGAAGACCATACCACCAC-3′和反向,5′-ATTACCAGCTTCGTCCCTTTC-3′;Bcl-2正向,5′-GGTGGGTCATGTGTGG-3′和反向,5′-CGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′;Bax正向,5′-CCCGAGAGGTCTTTTCCGAG-3′和反向,5′-CCAGCCAATGATGGTTCGAT-3′;和GAPDH正向,5′-GGAGCGAGATCCCCCAAAAAT-3′和反向,5′-GGCTGTGTCACTTCATTCATGG-3′。热循环条件如下:95℃下初始变性2 min;95°C下变性30秒;59°C退火45秒,72°C伸长率60秒,循环30次,然后72°C延伸率7分钟。

蛋白质印迹分析

根据制造商的协议,使用放射免疫沉淀分析分析缓冲液(cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA,USA)提取总细胞蛋白。使用BCA蛋白质检测试剂盒(Pierce;Thermo Fisher Scientific,Inc.)测定蛋白质浓度。使用10%SDS-PAGE分离等量的蛋白质(30µg/lane),并转移至聚偏氟乙烯膜(EMD Millipore,Billerica,MA,USA)。然后用5%的非脂肪乳在4℃下封闭膜2 h,并在4℃用一级抗体(抗PI3K,1:1000,ab151549;抗Akt,1:10000,ab179463;抗PTEN,1:10000,ab32199;抗Bcl-2 1:1000,ab32124;抗Bax,1:5000,ab32503;抗β-肌动蛋白,1:200,ab115777;全部购自美国马萨诸塞州剑桥市Abcam)。第二天,用辣根过氧化物酶结合二级抗体(1:1000;A0208;Beyotime生物技术研究所)清洗膜并在室温下培养45分钟,并使用ChemiDoc™XRS+成像系统进行检测(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)-内部控制采用肌动蛋白。

吉西他滨和5-氟尿嘧啶药敏试验

用不同浓度的吉西他滨(0.01、0.1、1、10和100µM;分类号95058-81-4;中国上海新余生物医药有限公司)或5-氟尿嘧啶(0.01、0.1,1、10和100µM,分类号51-21-8;中国武汉武汉武汉东康源科技有限公司)在37°C和5%Co条件下处理PANC-1细胞2如前所述,用MTT法测定活细胞百分比。

体内肿瘤异种移植模型

体内使用购自南京医科大学动物中心(中国南京)的4-6周龄雄性BALB/c裸鼠(体重15-20 g)进行肿瘤异种移植试验。所有动物研究方案均由上海浦东医院(中国浦东)动物护理和使用机构委员会批准。将小鼠随机分为三组(每组5只),并在无病原体的环境控制室(温度,22°C±2°C;湿度,50-65%;12小时光/暗循环)中饲养7天,免费获得标准动物饲料和过滤自来水,以适应新环境。随后,将PANC-1细胞(未转染或转染miR-183抑制剂或抑制剂对照)皮下注射到单独的裸鼠(5×106每只老鼠的细胞数),在实验期间,他们仍然可以免费获得食物和水。注射后30天对所有小鼠实施安乐死,并测量肿瘤大小。肿瘤大小的计算公式如下:肿瘤体积=肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤高度/2。使用Sartorius电子天平(中国苏州科学仪器有限公司)测量肿瘤重量。

双荧光素酶报告分析

为了评估潜在的miR-183相关靶基因,miRanda数据库(网址:www.microrna.org)用于预测可能的目标。结果表明PTEN是miR-183的潜在靶点。为了证实这一预测,在96孔板中进行了萤光素酶活性测定。pmirGLO质粒来自Promega Corporation(美国威斯康星州麦迪逊)。将PTEN 3′UTR pmirGLO质粒(含野生型或突变型PTEN 3’UTR;中国广州RiboBio有限公司)和使用Lipofectamine的miR-183抑制剂或抑制剂控制(NC)载体共同转染PANC-1细胞®根据制造商的协议,2000试剂(Invitrogen;Thermo Fisher Scientific,Inc.)。3′UTR-野生型(WT)包括含有野生型PTEN 3′UTR pmirGLO质粒的PANC-1细胞。3′UTR突变体(MUT)组包括含有突变PTEN 3′UTR-pmirGLO质粒的PANC-1细胞。作为控件,包含雷尼利亚荧光素酶共转染正常化。转染后48小时,firefly和雷尼利亚根据制造商的说明,使用双荧光素酶报告系统(Promega公司)对荧光素素酶进行分析。萤火虫发光归一化为雷尼利亚.

如果miR-183种子序列与PTEN 3′UTR相匹配,则miR-83种子序列激活了PTEN 3’UTR以降低荧光素酶基因的表达。减少的荧光素酶与底物反应产生微弱荧光,双荧光素素酶报告系统检测到该荧光,证明miR-183种子序列可以与PTEN 3′UTR相匹配。

统计分析

所有统计分析均使用SPSS 19.0(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行。数据表示为平均值±标准偏差。使用Student t检验确定两组数据集之间的统计显著性。采用单因素方差分析和事后LSD检验评估多组之间的比较。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。

结果

miR-183在PANC-1细胞中上调

采用RT-qPCR检测miR-183在PC细胞中的表达水平。如所示图1A与H6C7细胞相比,PANC-1细胞中miR-183的表达显著上调(P<0.01)。这些结果表明miR-183可能是与PC相关的潜在标记物。

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miR-183敲低抑制胰腺癌细胞的细胞增殖。(A) H6C7和PANC-1细胞中miR-183的相对表达。(B) 转染后PANC-1细胞中miR-183的相对表达。(C) MTT法测定细胞增殖率。(D) MTT分析的代表性图像显示miR-183转染对PANC-1细胞增殖的影响(放大倍数×100)**与NC相比P<0.01,与NC.miR,microRNA相比***P<0.001;NC,未转染组;BL,抑制剂对照组;miRNA,miR-183抑制剂组。

miR-183敲除抑制PANC-1细胞的细胞增殖

为了研究miR-183在PANC-1细胞增殖、凋亡和细胞周期中的生物学功能,这些功能与肿瘤发生有关,用miR-183抑制剂转染PANC-1细胞,并使用MTT法评估其对细胞增殖的影响。如所示图1B与未转染细胞相比,miR-183抑制剂组miR-183的表达显著降低(P<0.01)。如所示图1C与未转染细胞相比,miR-183的敲除导致细胞增殖显著降低(P<0.001),表明miR-183s是PANC-1细胞增殖的正调控因子。如中所示图1D与未转染细胞相比,随着膜细胞骨架的破坏,PANC-1细胞数量显著减少,形态显著改变。

敲除miR-183促进体外PANC-1细胞凋亡并影响细胞周期

用流式细胞术评估miR-183在PANC-1细胞凋亡和细胞周期中的作用。如所示图2A与未转染组相比,转染miR-183抑制剂的细胞凋亡显著增加(P<0.01)。此外,与未转染细胞相比,G细胞中的细胞百分比1miR-183抑制剂转染组的时相显著增加(P<0.01;图2B).

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miR-183的敲除促进PANC-1细胞的凋亡并阻止其细胞周期体外(A)miR-183对PANC-1细胞凋亡的影响。(B) miR-183对PANC-1细胞细胞周期的影响**P<0.01 vs.NC.miR,microRNA;NC,未转染组;BL,抑制剂对照组;miRNA,miR-183抑制剂组。

敲除miR-183可延缓肿瘤生长

为了证实miR-183下调对肿瘤生长的抑制作用,体内将PANC-1细胞植入裸鼠体内,建立肿瘤异种移植模型。如所示图3A,miR-183抑制剂转染组的肿瘤大小明显小于未转染组,这与细胞增殖测定的结果一致。肿瘤生长曲线和肿瘤重量测定结果表明,miR-183基因敲除显著延缓肿瘤生长(P<0.01;图3B).

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敲除miR-183可延缓肿瘤生长。(A) 裸鼠解剖肿瘤的代表性照片。(B) 不同组的肿瘤生长曲线和肿瘤重量**与NC.NC,未转染组相比,P<0.01;BL,抑制剂对照组;miRNA,microRNA-183抑制剂组。

miR-183可能影响PANC-1细胞中PTEN/PI3K/Akt信号通路

已知PI3K途径可调节新陈代谢、细胞生长和细胞存活(23). 因此,为了进一步探讨miR-183对PANC-1细胞作用的潜在机制,我们进行了RT-qPCR和western blot分析,以研究miR-183对PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响。如中所示图4与未转染细胞相比,miR-183的敲低诱导了PANC-1细胞PTEN和Bax mRNA表达水平的显著增加,PI3K、Akt和Bcl-2 mRNA表达的显著降低(P<0.001)(图4A-E). 在蛋白质水平上观察到类似的显著差异(图4F).

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miR-183影响PANC-1细胞中PTEN/PI3K/Akt信号通路。采用逆转录定量聚合酶链反应检测(A)PTEN、(B)PI3K、(C)Akt、(D)Bax和(E)Bcl-2的mRNA水平。(F) 蛋白质水平通过western blotting进行评估***P<0.001 vs.NC.miR,microRNA;PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物在第10染色体上缺失;PI3K,磷脂酰肌醇3-激酶;蛋白激酶B;Bcl-2、B细胞淋巴瘤-2;Bax、Bcl-2相关X蛋白;NC,未转染组;BL,抑制剂对照组;miRNA,miR-183抑制剂组。

PTEN是miR-183的直接靶点

如所示图5A,miR-183种子序列与PTEN 3′-UTR相匹配。为了验证这一点,进行了双核糖核酸酶报告分析。结果表明,与对照组相比,miR-183显著抑制了含有野生型PTEN 3′-UTR的报告者的荧光素酶活性(P<0.05)(图5B). 在用含有PTEN突变型3′-UTR的报告基因转染的细胞中没有观察到显著的作用。这些结果表明PTEN是PANC-1细胞中miR-183的直接靶点。

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PTEN是miR-183的直接靶点。(A) 使用miRanda观察到PTEN mRNA的3′-UTR包含一个与miR-183互补的序列。(B) miR-183的过度表达显著抑制了PTEN的WT 3′-UTR报告子的荧光素酶活性,但对PTEN的突变型MT 3′-UTR报告子没有抑制作用*与10号染色体上缺失的NC.PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物相比,P<0.05;miR,microRNA;UTR,非翻译区;野生型野生型;MT,突变型;luc/R-luc,荧光素酶/雷尼利亚荧光素酶;NC,抑制剂对照转染组,对照,未转染组。

敲除miR-183增加PANC-1细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的体外化疗敏感性

最后,采用MTT法检测miR-183对PANC-1细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨化疗敏感性的影响。结果表明,miR-183的敲除显著增加了PANC-1细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的化疗敏感性(P<0.05;图6).

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miR-183基因敲除增加PANC-1细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的化疗敏感性体外(A)转染后5-氟尿嘧啶治疗对PANC-1细胞增殖的影响。(B) 吉西他滨治疗对转染后PANC-1细胞增殖的影响*P<0.05 vs.NC.miR,microRNA;NC,未转染组;BL,抑制剂对照组;miRNA,miR-183抑制剂组。

讨论

miR-183在PC中的作用已在前面讨论过。Yu使用微阵列分析(24)表明miR-183在胰腺上皮内肿瘤患者的组织样本中上调,表明miR-183可能在PC的发病机制中起重要作用(25)在胰腺导管腺癌(PDAC)组织样本和细胞系中观察到miR-183的低表达,结果表明miR-183的水平与疾病的严重程度、患者的生存和预后不良有关。此外,miR-183可以通过靶向B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒插入位点1影响PDAC细胞的增殖和凋亡。(26)据报道,miR-183可以通过靶向PDCD4调节PC细胞株SW1990的增殖、凋亡和侵袭,这表明miR-183具有作为PC治疗靶点的潜力。在最近的一项研究中,苗(27)表明miR-183-5p不仅可以促进人胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移,而且可以通过下调细胞因子信号抑制因子6的表达抑制胰腺癌细胞凋亡。在本研究中,用miR-183抑制剂转染PANC-1细胞,发现沉默miR-183诱导PANC-1细胞的增殖显著减少,凋亡显著增加;此外,miR-183抑制剂的转染也导致G1阶段。这些结果与之前的研究结果一致,表明miR-183可以调节PANC-1细胞的增殖、凋亡和细胞周期体外.

PTEN作为肿瘤抑制剂的作用已经得到了很好的研究。先前的研究表明,PTEN在胰腺癌、结肠癌和肝细胞癌中下调,并且PTEN被认为可以调节癌细胞(包括PC细胞)的增殖、凋亡、迁移和侵袭(2831). PI3K和Akt是PTEN的下游激酶。在癌症中,PTEN的下调导致PI3K/Akt信号通路的激活,这可能部分促进肿瘤的发生和发展(3234). 以往的研究结果表明,miRNAs可以通过靶向PTEN/PI3K/Akt信号调节癌细胞的增殖和凋亡(3234). 在本研究中,与未转染细胞相比,miR-183基因敲除诱导PANC-1细胞中PTEN和Bax的表达增加,PI3K、Akt和Bcl-2的表达在mRNA和蛋白质水平上降低。这些结果表明,miR-183可以影响PANC-1细胞中PTEN/PI3K/Akt信号通路。

目前,用于治疗PC的化疗药物是有限的。最常见的抗PC药物是DNA损伤化合物5-氟尿嘧啶和吉西他滨。然而,患者在此类治疗过程中可能会产生耐药性,导致疗效不佳(35,36). 近年来,人们研究了miRNAs在调节PC细胞药物敏感性中的作用。妈妈(37)最近有报道称miR-223可以调节吉西他滨耐药PC细胞的上皮-间充质转化;(38)证明miR-33a可以通过抑制β-连环蛋白的核转位来增强人PC细胞对吉西他滨的敏感性;世界环境学会(39)据报道,人类PC细胞中miR-21的过度表达可能通过抑制PTEN和PDCD4的表达而增加5-氟尿嘧啶的耐药性;(40)发现miR-320a可以通过靶向人类PC细胞中的PDCD4来增加化疗耐药性。在本研究中,采用MTT法研究miR-183在人类PC细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨化疗敏感性中的作用。本研究结果表明,沉默miR-183可以增加PANC-1细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的化疗敏感性。

总之,本研究结果表明,抑制miR-183可通过调节PTEN/PI3K/Akt信号通路,降低PANC-1细胞的增殖,促进细胞凋亡,并增强细胞对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的化疗敏感性。这些发现表明miR-183有可能成为PC的治疗靶点。

鸣谢

不适用。

基金

本研究得到了上海市浦东卫生局学术带头人培训项目(批准号:PWRd2016-04)、浙江省自然科学基金(批准号LY16H160045)和杭州市科技发展项目(批准编号:20150733Q16)的支持。

数据和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

作者的贡献

XY和BY对当前研究进行了概念化和设计,XY完成了大部分实验。XY、WW和XZ构建了体内建立肿瘤异种移植模型并进行随访解剖实验。QZ和LC培养细胞并进行细胞转染。XY、QZ和LC获取并解释了数据,并撰写了手稿。XY和BY发表了意见,提出了适当的修改建议并进行了更正。所有作者阅读并批准了最终手稿。

道德批准和参与同意

所有动物研究方案均由上海浦东医院(中国浦东)动物护理和使用机构委员会批准。

患者同意发布

不适用。

竞争性利益

作者声明,他们没有相互竞争的利益。

工具书类

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