Oncol Lett公司。2019年1月；17(1): 951–957.
SNHG20可预测口腔鳞癌的预后并促进细胞生长
, ,和
高鹏杰
上海中医药大学普陀医院口腔科，中国上海200062
芮凡
上海中医药大学普陀医院口腔科，中国上海200062
陶戈
上海中医药大学普陀医院口腔科，中国上海200062
上海中医药大学普陀医院口腔科，中国上海200062
2017年12月24日收到；2018年7月16日验收。
- 数据可用性声明
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
摘要
越来越多的证据表明，长非编码RNA（lncRNAs）在各种肿瘤类型中发挥着重要作用，包括结直肠癌和胃癌。本研究旨在探讨lncRNA小核仁RNA宿主基因20（SNHG20）在口腔鳞癌（OSCC）进展中的作用。结果表明，与邻近的非肿瘤组织标本相比，口腔鳞癌组织标本中SNHG20的表达显著增加。口腔鳞状细胞癌组织标本中SNHG20表达的增加与肿瘤分化和肿瘤结节转移阶段有关。Kaplan-Meier分析和log-rank检验表明，较高的SNHG20表达预示着OSCC患者的总体生存率（OS）较低。多变量Cox比例风险回归分析表明，SNHG20表达增加是OSCC患者OS的独立预测因素。敲低OSCC细胞中SNHG20的表达抑制增殖。SNHG20被敲除后，OSCC细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原和Ki67表达水平降低；因此，结果表明SHNG20可能是OSCC治疗的预测因子和潜在靶点。
关键词：口腔鳞癌，小核仁RNA宿主基因20，肿瘤预后，细胞增殖
介绍
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是最常见的肿瘤类型之一，2008年全球报告的新诊断病例超过50万例(1,2). 口腔鳞状细胞癌（OSCC）是全世界最常见的HNSCC亚型(2). 尽管该病的诊断和治疗取得了很大进展，但晚期口腔鳞癌患者的总5年生存率仍低于50%(3,4); 因此，研究有效的诊断生物标志物和治疗靶点对改善OSCC患者的预后具有重要意义。
长非编码RNA（lncRNAs）是一类大于200个核苷酸的非蛋白编码转录物，已被确定为OSCC进展的重要调节因子(5,6). 例如，lncRNA结肠癌相关转录物1（CCAT1）在口腔鳞状细胞癌中过度表达，并且据报道，口腔鳞状癌中较高的CCAT1表达可预测不良预后(7). 此外，lncRNA尿路上皮癌相关1（UCA1）通过调节WNT/β-catenin信号通路参与OSCC的进展(8). 此外，lncRNA转移相关的肺腺癌转录物1通过诱导OSCC中的上皮-间充质转化促进肿瘤生长和转移(9). lncRNA UCA1通过抑制microRNA-184（miR-184）的表达促进OSCC的增殖和顺铂抵抗(10). 上述研究表明lncRNAs参与了OSCC的进展。
定位于17q25.2的小核仁RNA宿主基因20（SNHG20）已被确定与多种肿瘤类型有关，包括结直肠癌和胃癌。SNHG20在结直肠癌中的表达显著上调，并增加细胞增殖(11). 此外，SNHG20通过抑制p21表达和调节糖原合成酶激酶-3β/β-catenin信号通路促进胃癌进展(12); 然而，SNHG20在OSCC中的作用尚不清楚。
在本研究中，与邻近的非肿瘤组织相比，OSCC组织中的SNHG20增加。较高的SNHG20表达预示着OSCC患者的总体生存率较低。此外，敲低OSCC细胞中的SNHG20抑制增殖能力；因此，结果表明SHNG20可以作为OSCC治疗的预测因子和潜在靶点。
材料和方法
临床组织标本
2008年4月至2013年7月，从上海中医药大学（中国上海）普陀医院口腔科的40名患者中获取了人体OSCC组织标本和匹配的相邻非肿瘤组织标本。切除后，立即将组织标本放入RNA中®然后将溶液（德国希尔顿Qiagen GmbH）储存在液氮中进行进一步分析。患者的临床病理因素总结如下所有患者均根据肿瘤淋巴结转移（TNM）和国际癌症控制联盟分类进行临床检查和分期(13). 随访时间是指从手术到最后一次随访的时间。本研究方案经上海中医药大学普陀医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意书。
表一。
口腔鳞癌患者SNHG20表达与临床病理特征的关系。
| | SNHG20表达 | |
|---|
| |
| |
|---|
| 临床病理特征 | 总计 | 减少（n=20） | 增加（n=20） | P值 |
|---|
| 年龄 | | | | 0.525 |
| ≤60 | 22 | 12 | 10 | |
| >60 | 18 | 8 | 10 | |
| 性别 | | | | 0.519 |
| 女性 | 16 | 7 | 9 | |
| 雄性 | 24 | 13 | 11 | |
| 吸烟状况 | | | | 0.527 |
| 没有 | 20 | 11 | 9 | |
| 是的 | 20 | 9 | 11 | |
| 肿瘤部位 | | | | 0.744 |
| 舌头 | 15 | 8 | 7 | |
| 不含糖 | 25 | 12 | 13 | |
| T级 | | | | 0.197 |
| T1-T2段 | 20 | 14 | 6 | |
| T3-T4层 | 20 | 6 | 14 | |
| 分化（13） | | | | 0.025一 |
| 良好且适度 | 23 | 15 | 8 | |
| 糟糕 | 17 | 5 | 12 | |
| 淋巴结转移 | | | | 0.185 |
| 没有 | 26 | 15 | 11 | |
| 是的 | 14 | 5 | 9 | |
| TNM阶段（13） | | | | 0.011一 |
| I–II级 | 22 | 15 | 7 | |
| III–IV | 18 | 5 | 13 | |
细胞系培养
共购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）的三株人口腔鳞癌细胞系（SCC4、HN4和SCC15）和正常人口腔角质形成细胞（NHOK）细胞系。细胞保存在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中（均来自HyClone；GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA）。所有细胞在37°C的含5%CO的湿空气中培养2.
逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）
从组织和细胞系中分离出总RNA，包括HN4SCC4、HN4、SCC15和含三唑的NHOK细胞®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。该cDNA是通过逆转录100 ng总RNA产生的。根据制造商的协议，通过Prime Script RT试剂盒（中国大连塔卡拉生物科技有限公司）进行逆转录分析以获得互补DNA（cDNA）。用SYBR检测SNHG20的相对表达®使用Step One Plus实时PCR系统（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）的Green Master Mix（Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan）。GAPDH作为内源性对照。SNHG20的相对表达定量使用2-ΔΔCq方法(14). qPCR的热循环条件为：95°C 3 min，然后是40个95°C循环12秒和58°C循环40秒。引物由上海基因制药有限公司（中国上海）合成。引物序列如下：SNHG20，正向，5′-ATGGCTAAAATAGATACACCC-3′，反向，5′-GGTACAAACAGAGAGAGGA-3′；和GAPDH，正向，5′-ACAGTCAGCCATCTTCT-3′和反向，5′-GACAGCTTCCCGCCTCAG-3′。
细胞转染
从上海基因制药有限公司购买了两种抗SNHG20的小干扰RNA（siRNAs），其序列如下：si-NC，5′-GGATACGTATAGC-3′；si-SNHG20-1，5′-GCCUAGGAUCAUCCAGGGUUTT-3′；和si-SNHG20-2，5′-GCACUCACAGAGUGUAUTT-3′。当细胞融合率达到80–90%时，用脂质体转染100 nm硅阴性对照（si-NC）、si-SNHG20-1或si-SNHG20-2到SCC4或SCC15细胞®2000试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.），根据制造商的协议。转染后48小时收集细胞。
细胞增殖试验
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8；中国南通贝尤泰生物技术研究所）检测细胞增殖能力。随后，将SCC4和SCC15细胞接种到96个平板（2×103细胞/孔），并转染si-NC、si-SNHG20-1或si-SNHG-20-2。细胞转染后1、2、3和4天，使用10µl CCK-8试剂对细胞进行染色。在37°C下培养2小时后，使用微孔板阅读器（Enspire 2300 Maltilabel reader；PerkinElmer，Inc.，Waltham，MA，USA）测量细胞增殖能力，并在450 nm处测量样品的吸光度。
集落形成分析
每组转染细胞接种于12孔板（5×102细胞/孔），并在含5%CO的湿空气中37°C培养14天2随后，菌落在室温下用100%甲醇固定20分钟，在室温下使用0.1%结晶紫染色20分钟。最后，在X71荧光显微镜下对细胞进行计数和成像（放大倍数为×200；日本东京奥林巴斯公司）。
蛋白质印迹分析
SCC4和SCC15细胞用放射免疫沉淀分析缓冲液（Beyotime生物技术研究所）进行分析，并根据制造商的协议，使用双辛酸蛋白分析试剂盒（Sigma-Aldrich；德国达姆施塔特Merck KGaA）进行定量。A.在10%SDS-PAGE电泳上分离出总共20µg总蛋白裂解物，然后转移到聚偏氟乙烯膜（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）。使用5%的游离脂肪乳在室温下封闭膜1小时，然后与抗增殖细胞核抗原（PCNA）（分类号ab92552；稀释度1:3000；Abcam，英国剑桥）、抗Ki67（分类号ab15580；稀释度：1:3000；Abcam）和抗GAPDH（分类号sc-20358，稀释度：1:1000；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，CA，USA）抗体在4°C下过夜。随后，在室温下用与辣根过氧化物酶（稀释度为1:5000；类别号为ab97040；Abcam）结合的二级抗体抗鼠IgG孵育细胞膜2小时，并用增强化学发光检测系统（GE，Fairfield，CT，USA）观察蛋白印迹。使用ImageJ 1.45S软件（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）对蛋白质条带进行可视化。
统计分析
本研究中的数据分析使用SPSS 20.0（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）进行。结果显示为平均值±标准偏差。使用χ2测试。采用Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）以及Student-Newman-Keuls-q检验分析各组间差异的显著性。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
SNHG20在口腔鳞癌组织中的表达增加与组织分化和TNM分期有关
检测SNHG20在40例人口腔鳞癌组织标本和匹配的邻近非肿瘤组织标本中的表达。如所示与匹配的相邻非肿瘤组织标本相比，OSCC组织标本中SNHG20的表达显著增加（P<0.05）。此外，与NHOK细胞系相比，SNHG20在三种OSCC细胞系（SCC4、HN4和SCC15）中的表达显著增加（P<0.05；). 为了了解SNHG20在患者中的表达的临床意义，用χ2测试。结果表明，SNHG20过度表达与组织分化减少和晚期TNM分期显著相关（III-IV期；P<0.05；) (13).
在OSCC组织中检测到SNHG20表达增加，并与OS较差有关。（A） 与RT-qPCR检测的相邻非肿瘤组织相比，OSCC组织中SNHG20的表达显著增加。（B） 与NHOK细胞系相比，SNHG20在三种人类OSCC细胞系（SCC4、HN4和SCC15）中的表达显著增加。（C） SNHG20表达对患者OS影响的Kaplan-Meier分析。（D） 当SCC4和SCC15细胞转染si-NC、si-SNHG20-1或si-SNHG10-2时，用RT-qPCR检测SNHG20的相对表达。误差条表示≥3个独立实验的平均值±标准偏差，*与si-NC、RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应相比，P<0.05；口腔鳞癌；SNHG20，小核仁RNA宿主基因20；NHOK，正常人口腔角质形成细胞；si-NC，小干扰阴性对照；OS，整体生存率。
SNHG20表达增加是OSCC患者总生存期（OS）的预测因子
生存图采用Kaplan-Meier方法进行绘制，并与对数秩检验进行比较。结果表明，与SNHG20表达降低的患者相比，OSCC患者SNHG20-表达增加降低了他们的OS(). 单因素分析结果表明，肿瘤分化不良、临床分期晚期和SNHG20表达增加是OSCC患者OS的独立预测因素，且这些相关性显著（P<0.05；). 此外，多变量Cox比例风险回归分析表明，肿瘤分化不良、临床分期晚期和SNHG20表达增加是OSCC患者OS的独立预测因素，且这些相关性显著（P<0.05；); 因此，这些结果表明SNHG20表达增加可能是OSCC患者OS的独立预测因子。
表二：。
口腔鳞癌患者SNHG20表达和OS的单变量和多变量Cox比例风险分析。
| 单变量Cox分析 | 多元Cox分析 |
|---|
|
|
|
|---|
| 临床病理特征 | RR（95%置信区间） | P值 | RR（95%置信区间） | P值 |
|---|
| 年龄 | 0.788 (0.355–1.477) | 0.655 | | |
| 性别 | 1.088 (0.546–1.877) | 0.565 | | |
| 吸烟状况 | 0.927 (0.443–1.788) | 0.588 | | |
| 肿瘤部位 | 1.156 (0.577–1.993) | 0.422 | | |
| 不含糖 | 0.655 (0.301–1.444) | 0.723 | | |
| T级 | 0.756 (0.404–1.466) | 0.688 | | |
| 分化（13） | 2.131 (1.587–2.977) | 0.001一 | 1.896 (1.448–2.745) | 0.002一 |
| 淋巴结转移 | 1.223（0.779–1.987） | 0.332 | | |
| TNM阶段（13） | 2.289 (1.642–3.224) | 0.001一 | 1.966 (1.246–3.009) | 0.001一 |
| SNHG20系列 | 2.556 (1.822–3.663) | 0.001一 | 2.077 (1.388–3.244) | 0.001一 |
SNHG20表达减少抑制细胞增殖
还研究了SNHG20表达对OSCC细胞增殖的影响。在两个SNHG20表达增加的OSCC细胞系（SCC4和SCC15细胞）中，SNHG20-表达被抑制。两种siRNAs的敲除效率增加，如图所示采用CCK-8细胞增殖和细胞集落形成实验检测细胞增殖能力。CCK-8结果表明，SNHG20表达降低显著抑制SCC4和SCC15细胞的增殖能力，与各自的阴性对照组相比（P<0.05；). 此外，集落形成实验结果表明，与各自的阴性对照组相比，SNHG20表达降低显著减少SCC4和SCC15细胞集落的数量（P<0.05；). 此外，与各自的阴性对照组相比，SNHG20敲除下调了SCC4和SCC15细胞中PCNA和Ki67的表达(). 目前的结果表明，SNHG20表达降低抑制了细胞增殖。
SNHG20表达减少抑制细胞增殖。采用细胞计数试剂盒-8细胞增殖试验检测（A）SCC4和（B）SCC15细胞转染si-NC、si-SNHG20-1或si-SNHG20-2后的细胞增殖能力。采用细胞集落形成实验检测（C）SCC4和（D）SCC15细胞转染si-NC、si-SNHG20-1或si-SNHG20-2后的细胞增殖能力。误差条表示与≥3个独立实验的平均值±标准偏差，*与si-NC.SNHG20、小核仁RNA宿主基因20相比，P<0.05；si-NC，小干扰阴性对照；外径，光密度。
SNHG20表达减少抑制细胞增殖相关蛋白PCNA和Ki67的表达。（A） 用si-NC、si-SNHG20-1和si-SNHG20-2转染SCC4细胞，用western blot分析检测PCNA和Ki67的表达。（B） 转染si-NC、si-SNHG20-1和si-SNHG20-2后SCC4细胞的蛋白质定量分析*与si-NC相比，P<0.05。（C）用si-NC、si-SNHG20-1或si-SNHG20-2转染SCC15细胞时，用western blot分析检测PCNA和Ki67的表达。（D） 转染si-NC、si-SNHG20-1和si-SNHG20-2的SCC15细胞的蛋白质定量分析*与si-NC、PCNA、增殖细胞核抗原相比P<0.05；SNHG20，小核仁RNA宿主基因20；si-NC，小干扰阴性对照。
讨论
最近的证据表明，lncRNA作为调节分子介导细胞过程，包括染色质重塑、转录、转录后修饰和信号转导(15,16). lncRNAs可影响细胞增殖、细胞凋亡、分化和侵袭，在生物过程中发挥重要作用(17,18). lncRNAs在口腔鳞状细胞癌进展中的作用可以为该病的诊断和治疗提供策略。SNHG20是一种最近确定的RNA分子，被确定为多种肿瘤类型中的癌基因，包括结直肠癌和胃癌。然而，据我们所知，SHNG20在OSCC中的预后价值和功能作用尚不清楚。在本研究中，结果表明，与邻近的非肿瘤组织标本相比，口腔鳞癌组织标本中SNHG20的表达增加。SNHG20过度表达与组织分化减少和临床晚期相关。多变量Cox比例风险回归分析表明，SNHG20表达增加是OSCC患者OS的独立预测因子。
在之前的研究中，与相应的非肿瘤组织相比，SNHG20在结直肠癌组织中的表达增加，SNHG20的高表达与结直肠癌患者的晚期TNM分期显著相关(11). 此外，SNHG20的上调预测肝细胞癌患者的总体生存率较低。SK-Hep-1细胞中SNHG20的敲除显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭(19). SNHG20通过调节miR-495促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移(20). 一致地，目前的结果表明，SNHG20表达的减少抑制了细胞增殖能力和细胞集落形成能力。此外，SNHG20的表达降低降低了OSCC细胞中PCNA和Ki67的表达。PCNA和Ki67是细胞增殖标记物，其合成速率与细胞增殖和DNA合成速率直接相关(21). 本研究结果表明，SNHG20可能通过潜在机制影响PCNA和Ki67的表达。这些结果表明，SNHG20表达降低抑制了细胞增殖。此外，在未来体内应进行实验，以证明SNHG20在OSCC中的作用。
总之，在本研究中，证实了SNHG20在口腔鳞癌组织和细胞中的表达升高。SNHG20表达增加可作为OSCC组织的预后预测因子。此外，SNHG20表达降低可抑制OSCC的细胞增殖；因此，这些结果表明SNHG20可以作为OSCC的预后预测因子和OSCC治疗的靶点。此外，OSCC进展的确切分子机制需要进一步研究。
数据和材料的可用性
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
作者的贡献
PG对研究的设计做出了贡献，并负责项目设计、组织、手稿撰写、实验进度监督和待出版版本的最终批准。PG、RF和TG进行了分子实验。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。
道德批准和参与同意
本研究方案经上海中医药大学普陀医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意书。
患者同意发布
所有患者均获得书面知情同意书并同意发表。
工具书类
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