NUMB通过促进PTEN和GLI1在成骨细胞中的泛素化降解来维持骨量

麻木的/数字受损成骨细胞存活与成骨分化

在DKO小鼠中对9周龄小鼠的股骨远端进行骨组织形态计量学（表2). 甲苯胺蓝染色显示N.Ob/T.Pm显著下降（图100万). MAR（图1公里)和MS/BS（图1l） 根据双重标记的测量结果，分别减少了37.58%和48.49%（图1日). 尤其是在DKO小鼠的血清中，OCN的浓度显著下降（图1个). 这些结果表明麻木的和Numbl（数字）抑制骨骼形成。

分离原代BMSC并在成骨培养基中培养，以评估分化受损。第7天的ALP染色显示，DKO组中的ALP阳性菌落保持在极低水平（图2a个). 正如预期的那样，矿化菌落的数量在第28天也显著减少（图2亿). 在转录水平上，骨标记的表达，包括阿尔卑斯山,英国标准普尔,奥肯、和第1a1列，在DKO组中急剧下降（图2厘米). 最明显的是，关键转录因子的表达水平，运行2、和奥斯克斯被下调，如qRT-PCR所示（图二维)和Western Blot（图第二版).

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图2

这个麻木的和Numbl（数字）切除成骨细胞可抑制增殖和分化，促进细胞凋亡。在完全培养基中培养骨髓基质细胞（BMSC），并在第7天用成骨分化培养基处理。碱性磷酸酶染色(一)第7天进行（红色），Von Kossa染色(b条)在第29天进行标记矿化基质（黑色）。c（c）成骨基因的mRNA水平(阿尔卑斯山,Bsp公司,奥肯和第1a1列)和(d日)关键转录因子(运行2和奥斯克斯）用RT-qPCR对培养的骨髓间充质干细胞进行分析，并归一化为β-肌动蛋白。所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.e（电子）RUNX2和OSX的Western Blot。将分离自N/NL融合小鼠的Calvarial成骨细胞转染腺-GFP（CTRL）或腺-核心-GFP（ΔN/NL）病毒，并在成骨培养基中培养。GAPDH用于归一化。如果腺病毒感染21天后进行Von Kossa染色。克骨标志物的qRT-PCR结果(阿尔卑斯山,英国标准普尔,奥肯,第1a1列,深度mp1和Phex公司)Cre转染两天后。β-actin用于归一化。所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.小时第2天5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色（绿色）的代表性图像用于评估细胞增殖；细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺，50 微米。我EdU阳性细胞归一化为DAPI阳性细胞后进行定量。所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.j个细胞增殖标记物(细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1)ΔN/NL成骨细胞。β-actin用于归一化。所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.k第2天流式细胞术显示成骨细胞凋亡的点图。在FL2中扫描Annexin V-PE，而在FL3中扫描7-AAD。我细胞凋亡标志物的qRT-PCR结果(第53页,Bcl-2型和Bcl-x公司). β-actin用于归一化。所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.米用于裂解半胱天冬酶-3的Western Blot。GAPDH用于归一化

从N/Nl-floxed小鼠颅盖骨中分离出原代成骨细胞，并通过添加Adeno-Cre-GFP病毒（ΔN/Nl成骨细胞）诱导基因敲除，以专门评估数量/数量在成骨细胞上。成骨细胞特异性缺失麻木的/Numbl（数字）减少了矿化基质的面积（图第2页). 的表达式奥肯,第1a1列、和深度mp1减少，而阿尔卑斯山,Bsp公司、和菲克斯无明显变化（图2克). 因此麻木的和Numbl（数字）降低成骨细胞的分化和功能。

在体外进行5-乙炔基-2´-脱氧尿苷（EdU）测定，以测试ΔN/NL成骨细胞的细胞增殖率。正常化后，DKO组EdU阳性成骨细胞的数量低于WT组（图2小时和i）。qRT-PCR分析表明，与ΔN/NL成骨细胞增殖相关的关键基因的表达(细胞周期蛋白A2、D1、和细胞周期蛋白E1)不同程度的下降（图第2节). 接下来，用Annexin V–PE（FL2）和7-AAD（FL3）双重染色细胞后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。在双基因敲除的情况下，早期凋亡的细胞比例从3.7%增加到14.6%麻木的和Numbl（数字）（图2公里). 的表达式第53页和Bcl-x公司增加，而Bcl-2型被抑制（图2升). Western Blot分析显示细胞质叶caspase-3显著升高（图200万). 这些数据表明麻木的/数字敲除抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制成骨细胞存活。

删除麻木的/Numbl（数字）成骨细胞中PTEN增加而不是Notch活化

NUMB通常被认为是Notch信号通路的负调控因子。因此麻木的应增加Notch信号通路的活性³⁰然而，检查主要Notch靶基因的表达，包括赫斯1,赫斯5,你好1、和海利牌手表，未发现ΔN/NL成骨细胞中Notch信号活性的任何增强激活（图3a年). Western Blot显示，ΔN/NL成骨细胞中毛状细胞和分裂增强因子-1（HES1）的NICD没有显著变化（图3亿). 此外，还进行了荧光素酶分析，以监测Jk重组信号结合蛋白（RBP-Jk）转录因子的活性。然而，ΔN/NL和CTRL成骨细胞之间的Notch信号通路没有发现显著差异（图3立方厘米). 此外，数字/数字敲除并没有导致细胞溶质或核NICD水平的变化（补充图S6系列).

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图3

这个数字和Numbl（数字）缺陷促进PTEN而非Notch。一三重qRT-PCR测量Notch靶基因的表达(赫斯1,赫斯5,你好1和海利牌手表).b条ΔN/NL成骨细胞中NUMB、NICD、HES1和PTEN的Western Blots变化。腺病毒转导两天后提取全细胞裂解物和RNA。GAPDH用于归一化。c（c）用Rbp-jk报告子或阳性/阴性对照质粒瞬时转染ΔN/NL和CTRL成骨细胞。额外设置Ad-NICD（阳性）和DAPT（阴性）对照，以观察该试验的效率。荧光素酶水平归一化为Renilla荧光素酶，并以折叠变化的形式显示，以监测Notch激活。误差条表示三次转染的标准偏差。所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.d日WT和DKO小鼠股骨石蜡切片的两个图像，分别用抗PTEN（红色）免疫染色和苏木精（蓝色核）复染。黑色和蓝色箭头分别表示骨骼表面或附近的阳性信号。比例尺，100 微米。e（电子）一种PTEN特异性抑制剂挽救了ΔN/NL成骨细胞中抑制的成骨作用。VO-Ohpic（5 µM）与ΔN/NL成骨细胞孵育。Alizarin Red用于标记矿化基质。如果骨骼标记(Ocn、Col1a1和Dmp1); 增殖标记物(细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D1)和凋亡标记物(第53页，Bcl-2). 数据归一化为β-肌动蛋白。所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05. Akt中信号分子的蛋白质印迹(克)和mTOR途径(小时). GAPDH用于归一化

然而，PTEN是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）的负调控因子^31,32，发现明显增加（图3亿). 然后，使用PTEN抗体对WT和DKO小鼠的石蜡切片进行免疫染色，发现PTEN的表达在小梁骨表面（黑色箭头）或附近（蓝色箭头）显著升高（图三维). VO-Ohpic，一种PTEN特异性化学抑制剂³³，部分挽救了由麻木的体外缺失（图三e、 f）。在ΔN/NL成骨细胞中，S380的pan PTEN和磷酸化PTEN均增加，而T308和S473的Akt磷酸化降低（图三g） ●●●●。因此，mTOR通路的下调（图3小时)检测到。这些数据共同表明麻木的缺陷通过提高成骨细胞的细胞质PTEN水平而不是Notch水平来抑制Akt途径。

泛素化减少导致PTEN在麻木的/Numbl（数字）-成骨细胞缺陷

NUMB通过与泛素连接酶ITCH结合，参与泛素降解过程，导致NOTCH或GLI1的破坏并抑制其功能^20,34同样，泛素介导的蛋白酶体降解是影响PTEN稳定性的关键机制³⁵因此，NUMB可能调节PTEN的泛素化。Kim等人证明NUMB和PTEN能够在前列腺癌细胞中形成复合物³⁶因此，本文探讨了成骨细胞中NUMB和PTEN之间物理相互作用的可能性。NUMB与PTEN在原代颅骨成骨细胞中共同免疫沉淀，以验证这一假设。两组的条带都检测到相应大小，这证明了成骨细胞中NUMB和PTEN之间的内源性相互作用（图4a、 b）。然后进行泛素化分析，并且间泛素,m-铂、和m-数量质粒转染MC3T3-E1细胞。m-编号转染显著增强了泛素化PTEN（Ub-PTEN）的形成（图4c类，第7车道对第8车道）。这些结果表明NUMB可能促进PTEN在成骨细胞中的泛素化。

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图4

NUMB促进PTEN在成骨细胞中的泛素化。原代颅骨成骨细胞中NUMB和PTEN的共免疫沉淀。用抗NUMB免疫沉淀细胞裂解物（兔）(一)，抗PTEN（兔子）(b条)或兔IgG和抗PTEN免疫印迹（山羊）(一)或抗NUMB（山羊）(b条)抗体。c（c）NUMB促进PTEN的泛化。GFP共转染MC3T3-E1细胞-m-编号，绿色荧光粉-间泛素和FLAG-m-铂质粒。用抗FLAG抗体（山羊）免疫沉淀细胞提取物，用抗泛素（兔子）鉴定共沉淀泛素。d日NEDD4-1参与PTEN在MC3T3-E1细胞中的泛素化。用FLAG-m联合转染细胞-内德4-1，GFP-m-泛素和FLAG-m-铂族质粒。第五道显示细胞与10 用于6的µM MG132 h、 1–4号车道与二甲基亚砜混合培养。用抗PTEN抗体（山羊）对细胞提取物进行免疫沉淀，并用抗泛素（兔子）鉴定共沉淀的泛素。e（电子）NUMB与NEDD4-1在原代颅骨成骨细胞中共同免疫沉淀。用抗NUMB（山羊）或山羊IgG免疫沉淀细胞裂解物，并用抗NUDB（兔）抗体免疫印迹。如果如果没有NEDD4-1的参与，NUMB对PTEN泛素化的正调控就无法实现。用编码GFP-m的质粒共转染MC3T3-E1细胞-麻木的，GFP-m-泛素，标志m-铂族和si-奈德4.转染两天后，细胞被裂解。用抗FLAG琼脂糖珠将PTEN拉下，用抗泛素免疫印迹法检测泛素化PTEN（Ub-PTEN）

蛋白质的泛素化需要相应的E3连接酶，NEDD4–1是PTEN通过泛素化的负调控因子³⁵从结构上看，ITCH和NEDD4–1都属于NEDD4家族，其WW域是与底物和适配器相互作用的主要介体³⁷NUMB的磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域与ITCH的WW1/2结构域结合以调节NOTCH泛素化³⁴从而假设NUMB可以与NEDD4-1相互作用，以多种潜在方式影响其对PTEN的调节。因此，本研究进行了序列比对，以确定人类ITCH和人类NEDD4域之间的相似区域（补充图S7a公司，b）。功能WW1（补充图S7a公司)和WW2（补充图S7b)ITCH中的域与所有四个NEDD4 WW域相似。此外，人类和小鼠的NUMB在PTB域中共享完全相同的序列（补充图S7c). 然而，ITCH在WW域中共享99.25%的身份（补充图S7d). 尽管缺少WW3域，但小鼠NEDD4与其余三个人类域的序列保持高度一致。值得注意的是，人类和小鼠NEDD4的WW1/2结构域之间的相似性分别超过94.12%和88.24%（补充图S7e). 因此，上述生物信息学分析暗示了NUMB可能参与NEDD4对PTEN的调控。在分子水平上m-Nedd4-1号机组质粒显著促进了Ub-PTEN的产生（图第4天MC3T3-E1小区中的车道3与车道4）。此外，服用MG132（一种经典的化学蛋白酶体抑制剂）显著促进了这一过程（图第4天，车道5）。接下来，进行联合免疫沉淀分析，以验证NUMB和NEDD4-1之间的物理相互作用（图第四版). 通过引入内德4-1加入泛素化分析的siRNA抑制了由m-编号转染（图第4页，车道1与车道5）。这些结果表明，NUMB缺失通过抑制NEDD4-1依赖的泛素介导的蛋白酶体降解PTEN来增强PTEN的稳定性。

食宿麻木的/Numbl（数字）成骨细胞介导破骨细胞生成的激活

TRAP染色用于探索破骨细胞是否有助于骨质减少，在DKO小鼠的小梁骨上发现破骨细胞数量显著增加（图第5页). 破骨细胞数量/组织周长比增加（N.Oc/T.Pm；图5厘米)，破骨细胞数量/骨表面（N.Oc/BS；图5天)和破骨细胞表面（图第五版)使用组织形态计量学检测（表2). 此外，DKO小鼠血清中的抗酒石酸ACP5显著增强（图第5页). 这些数据提供了DKO小鼠骨吸收活性提高的证据。

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图5

击倒麻木的和数字成骨细胞促进破骨细胞生成。一WT和DKO股骨石蜡切片TRAP染色显示骨表面有破骨细胞。比例尺，50 微米。b条抗酒石酸酸性磷酸酶5（ACP5，n个 = 12） 在WT或DKO小鼠的血清中。数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05. 基于TRAP染色的组织形态计量学：(c（c）)每个小梁骨周长的破骨细胞数量（N.Oc/T.Pm，n个 = 10);d日破骨细胞表面率（Oc.S/BS，n个 = 10); (e（电子）)破骨细胞平均表面（Oc表面，n个 = 10). 所示数据代表平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.如果将WT或DKO颅骨（底部）成骨细胞与来自WT或KDO小鼠的BMC（顶部）在48周板中共培养，TRAP染色和苏木精复染。克破骨细胞的数量被计数并显示为平均值 ± 扫描电镜*P（P） < 0.05.小时扫描电子显微镜（SEM）显示骨吸收坑的典型图像。比例尺，400 微米。我RAW264.7细胞在48周板的ΔN/NL或CTRL成骨细胞表面共培养，TRAP染色。j个 麻木的ΔN/NL成骨细胞的过度表达增强了破骨细胞的生成。ΔN/NL成骨细胞转染GFP-m-麻木的质粒。转染后2天，RAW264.7细胞接种于成骨细胞表面，10天后用TRAP染色。kΔN/NL或CTRL成骨细胞在具有0.4 μm孔隙；RAW264.7细胞在较低的24孔板中共同培养，10天后进行TRAP染色

进行成骨细胞-骨髓细胞（BMC）共培养试验，以检测细胞丢失麻木的和Numbl（数字）成骨细胞中的破骨细胞发生（图第5页). 接种在DKO成骨细胞上的BMC产生的破骨细胞远远多于接种在WT成骨细胞中的BMC（图第5页，g）。在DKO组中发现破骨细胞引起的吸收面积更大（图5小时). 当RAW264.7巨噬细胞系代替BMC共同培养时，麻木的-缺乏的成骨细胞刺激更多TRAP阳性细胞（图第5页). 此外m-编号质粒转染显著减弱了破骨细胞诱导的ΔN/NL成骨细胞的作用（图5焦耳). 此外，通过将ΔN/NL或CTRL成骨细胞植入孔径为0.4-μm的上孔，同时在下24孔板上共同培养RAW264.7细胞，进行跨孔分析。ΔN/NL成骨细胞刺激更多TRAP阳性多核RAW264.7细胞（图5公里和补充图S8). 鉴于这两个腔室之间不存在细胞-细胞直接接触或细胞迁移，结果表明ΔN/NL成骨细胞通过某些分泌和可溶性因子促进破骨细胞生成。

微型计算机断层扫描分析

从9周龄小鼠中分离股骨，用10%福尔马林固定并转移到70%乙醇中。VIVA 40CT 64GB（Scanco Medical AG，Bassersdorf，Switzerland）系统用于扫描胫骨平台近端500层。骨小梁的显微结构特性，包括BV/TV、Tb。Th、Tb。N、 Tb、。Sp和骨密度（BMD）是根据生长板旁边的100层来计算的。对500层BA/TA进行评估。对体素为10的扫描应用高斯滤波器（σ，0.8；支持，1） 微米。相应的参数设置如下：X射线管电位，55kVp；X射线强度，145 μA；积分时间，200 毫秒；和阈值，220 毫克·厘米^-三.

组织形态计量分析

钙蛋白（3 毫克·千克^-1; Sigma）和二甲酚橙（90 毫克·千克^-1; 在处死前10天和2天分别将Sigma）注射到9周龄小鼠体内。股骨或胫骨在4%多聚甲醛（PFA）中固定24 h.对于冰冻切片，用30%蔗糖溶液将未钙化骨脱水24小时 h、 嵌入最佳切割温度化合物（樱花）中，切割厚度为5-7 μm，使用徕卡CM1850紫外线低温恒温器，并使用胶带系统传输。用1%钙黄绿素蓝（Sigma）复染后，在荧光显微镜（Olympus IX71）下拍摄部分切片，以测定矿物并置率（MAR）和矿物表面率（MS/BS），同时选择部分切片进行Von Kossa/Van Geison染色。对于石蜡切片，股骨在15%乙二胺四乙酸中脱钙约1个月，在分级乙醇中脱水，渗透到二甲苯中，并小心地嵌入石蜡中。用苏木精和伊红（H&E）对约5μm的连续切片进行染色并拍照（奥林巴斯BX53）。甲苯胺蓝染色用于量化每个小梁骨周长（N.Ob/T.Pm）的成骨细胞数量，并进行抗酒石酸磷酸酶（TRAP）染色以确定骨吸收相关指数。这包括N.Oc/T.Pm，Oc。S/BS和破骨细胞表面。

原代细胞培养

用25号针头从9周龄WT和DKO同窝婴儿的股骨和胫骨中冲洗骨髓基质细胞。然后将其培养在添加了10%胎牛血清（HyClone）和1%青霉素/链霉素（HyClone）的改良α-MEM（Hy克隆）中。在第7天，在含有10 毫摩尔·升^-1地塞米松（西格玛），10 毫摩尔·升^-1β-磷酸甘油（Sigma）和50 μg·mL^-1抗坏血酸（Sigma）。培养在第28天终止。因此，在第7天进行布尔斯通碱性磷酸酶（ALP）染色以观察阳性菌落，在第28天进行Von Kossa染色以检查矿化情况。

从2个月大的N/Nl-floxed小鼠颅骨中消化原代成骨细胞。用0.2%胶原酶II（Sigma）和0.25%胰蛋白酶（HyClone）消化后，将其培养在完整的培养基中。如前所述，进行诱导细胞分化和成熟。通过添加腺-GFP（对照）或腺-核心-GFP（ΔN/NL）病毒（上海汉比奥）并刷新培养基2刺激基因敲除 小时后。然后，5 μmol·L^-1采用VO-Ohpic（MedChem Express）检测PTEN对DKO成骨细胞的影响。进行Von Kossa或茜素红染色以检查矿化。成骨细胞与含有50 μmol·L^-1EdU（广州Ribobio）2人 h评估细胞增殖。然后，根据提供的方案进行Apollo488染色，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚复染后，用荧光显微镜（Olympus）对EdU阳性细胞进行计数。Annexin V–PE/7–AAD检测（Keygen）根据提供的方案进行，以评估细胞凋亡。然后使用流式细胞术（Beckman Cytomics TM FC 500）分析凋亡早期和晚期的细胞比例。

荧光素酶检测

使用Cignal RBP-Jk报告子（luc）试剂盒（Qiagen），包括一个RBP-Jk报告子，带有阳性和阴性对照质粒。在96 well板中，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）将这些质粒转染至ΔN/NL成骨细胞。使用Adeno-NICD-GFP（上海汉比奥）和γ-分泌酶特异性化学抑制剂DAPT（MedChem Express）作为Notch水平的额外对照。48岁之后 h、 取出培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲剂轻轻清洗细胞。然后，20 将μL被动裂解缓冲液添加到双核糖核酸酶报告分析系统（Promega）中，并在室温下摇晃平板15 min。将荧光素酶分析试剂II转移到微孔中，并使用光度计（Varioskan Flash；Thermo Scientific）测量萤火虫发光。然后，100 添加μL Stop&Glo试剂，立即记录Renilla荧光素酶活性。所有转染程序均一式三份。

免疫组织化学和免疫细胞化学

使用含有0.2%吐温-20（西格玛）或0.5%Triton-X100（西格马）的PBS清洗组织切片或细胞，并根据Vectastain ABC-AP试剂盒（Vector Laboratories）或兔HRP-DAB试剂盒（R&D System）的标准协议进行染色。血红素用于复染，中性香脂用作固定介质。使用显微镜成像系统（奥林巴斯BX53）进行成像。涉及的主要抗体如下：抗NUMB（Abcam，ab14140）；抗PTEN（细胞信号技术，9188）；和抗GLI1（圣克鲁斯生物技术，sc-20687）。

免疫荧光染色

用添加了0.2%吐温-20（Sigma）或0.5%Triton-X100（Sigma-）的PBS清洗固定在4%PFA中的细胞，并用抗NICD（细胞信号技术，#4147）培养过夜。使用山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor®594，ab150080）标记红色NICD。在荧光显微镜（Olympus IX71）下拍摄照片。

RNA提取和定量逆转录聚合酶链反应分析

从长骨或细胞培养物中提取总RNA。在前一种情况下，附着的肌肉被清除，骨髓被冲走。在液氮中冷冻后，骨组织被磨成粉末并用TRIzol（Invitrogen）均质，然后离心悬浮液。接下来的步骤是按照TRIzol提供的方案进行的。使用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）和变性甲醛凝胶电泳鉴定RNA样品的浓度、纯度和完整性。cDNA是使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）合成的，定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）是使用QuantTect SYBR Green PCR试剂盒在CFX96实时系统（Bio-Rad）中进行的。选择β-肌动蛋白作为内部对照，并使用相对定量来计算结果（Ct）。对细胞培养物的RNA提取和qRT-PCR进行了类似的程序。补充信息中列出了qRT-PCR引物的序列（表三).

共培养和Transwell分析

第0天，第3天 × 10⁴将颅骨成骨细胞置于400μL完整培养基加10 纳克·毫升^-1胆钙化醇（Sigma）和10 毫摩尔·升^-1地塞米松（Sigma）置于48周板中。第2天、第3天 × 10⁵将新鲜分离的骨髓细胞（BMC）轻轻地添加到成骨细胞层的表面。在第5天和第9天，仔细更新50%的培养基，不会刺激成骨细胞层。第10天，所有细胞用4%PFA固定，并进行TRAP染色。对破骨细胞进行计数并拍照。在3 × 10⁵RAW264.7细胞接种于成骨细胞上。对于transwell测定，成骨细胞在transwell插入物（孔径：0.4 μm，Corning）和RAW264.7细胞接种在24孔板的下室。12天后，RAW264.7细胞固定并用TRAP染色。在救援试验中，GANT58（MedChem Express）的浓度设置为2.5  或7.5 μmol·L^-1。使用立体显微镜系统（徕卡EZ4 W）对所有24/48周的婴儿进行拍照。

骨吸收活性测量

用75%乙醇预先清洗过的牛股骨皮质骨制备骨片。在48-well板中对这些切片进行共培养分析。10天后，用超声波清除所有细胞。将骨切片安装在碳导电胶带上，并使用20千伏背散射电子在扫描电子显微镜（FEI，Inspect F50）下进行拍照。

Western Blot分析和联合免疫沉淀分析

使用哺乳动物蛋白质提取试剂（M-PER，Thermo Scientific）从原始BMSC或OB培养物中提取总蛋白质，并使用双茚试剂盒（Beyotime Biotechnology）测试浓度。使用10%聚丙烯酰胺凝胶和聚偏氟乙烯（PVDF）膜在4℃孵育过夜进行电泳 °C，在含有初级抗体的5%牛血清白蛋白中。所涉及的初级抗体如下：抗RUNX2（Abcam，ab23981）、抗OSX（Abcam，ab22552）、抗NUMB（Abcam，ab14140）、抗HES1（Abcam，ab108937）、抗PTEN（S380，Abcam，ab76431）、抗AKT（S473，Abcam，ab81283）、抗mTOR（Abcam，ab32028）、抗mTOR（S2448，Abcam，ab109268）、抗el4EBP41（Abcam，ab32024），anti-el4EBP41（T37，Abcam，ab75767），anti-GLI2（Abcam，ab167389），anti–cAMP响应元件绑定（CREB；Abcam；ab32515），anti-pCREB（Abcam、ab32096），anti-AKT（Cell Signaling Technology，#4691），antiaKT，抗S6（细胞信号技术，#2217）、抗S6、抗裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（细胞信号传递技术，#9664）、抗GLI1和抗GLI3（圣克鲁斯生物技术，sc-20688）。二级抗兔/羊抗体购自Abcam。使用小鼠抗甘油醛3-磷酸脱氢酶（Abcam，ab8245）、抗α-微管蛋白（Abcam，ab52866）或抗胺B（Abcam，ab133741）对蛋白质含量进行标准化。

对于联合免疫沉淀分析，从两个月大的C57B6J小鼠颅盖骨中分离出原代成骨细胞，并使用10 cm板中的完整培养基进行培养。用90%的汇合液收集细胞，用冷PBS洗涤，并使用细胞裂解缓冲液进行Western blotting和IP（Beyotime Biotechnology）裂解。通过添加正常兔免疫球蛋白G和蛋白A消除非特异性结合蛋白 + 琼脂糖。靶蛋白在4时免疫沉淀过夜 °C，使用anti-NUMB（Abcam，ab14140）和anti-PTEN（Cell Signaling Technology，#9188）。样品清洗五次，并使用Western blotting和抗PTEN（Abcam，ab201856）、抗NUMB（Abcam，ab4147）和抗神经前体细胞表达的发育下调蛋白4（NEDD4；Abcam（ab188867）一级抗体进行分析。

泛素化测定

MC3T3-E1细胞系购自美国类型培养库。编码GFP-NUMB、GFP-m-Ub、FLAG-PTEN、FLAG-NEDD4-1和相关对照质粒的质粒购自OriGene。利用DH5活性细胞（天根）和TIANpure质粒试剂盒（天根。使用NEDD4-1 siRNA（OriGene）敲除内德4-1和MG132（MedChem Express）用于抑制蛋白酶体。当MC3T3-E1细胞达到80%–90%的融合时，使用Lipofectamine 3000进行转染。转染4天后，使用抗FLAG（OriGene）或抗PTEN抗体（Cell Signaling Technology，#9188）免疫沉淀PTEN。然后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，并使用抗泛素抗体（Abcam）检测泛素。

酶联免疫吸附试验

从9周龄的WT和DKO小鼠中收集血清并储存在−80 摄氏度。酸性磷酸酶5、抗酒石酸酸性磷酸酶（ACP5）、骨钙素（OCN）、RANKL和OPG的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自Cloud Clone Corp.。使用平板阅读器读取结果。对数据进行统计分析。

我们要感谢David W Rowe提供第1a1-2.3-Cre列老鼠。本研究得到了四川大学口腔疾病国家重点实验室资助项目（四川大学，SKLOD201702）、国家优秀青年科学基金（81322013）、四川省创新团队（2015TD0011）和口腔疾病国家关键实验室启动资金的支持，四川大学华西口腔医学院（致刘鹏）。