PPAR（购电协议）γ通过交叉介导PI3K/AKT和cGMP/PKG信号抑制缺氧诱导的肝星状细胞活化

2.2. 试剂

8-Br-cGMP、Rp-8-Br-PET-cGMPS、LY294002、罗格列酮和扎普司特购自Sigma-Aldrich。740 Y-P由研发系统提供。将LY294002、罗格列酮和扎普司特溶解在二甲基亚砜中（最终浓度0.2%）。其他药物使用蒸馏水制备。

2.3. 血清参数检查

根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（中国武汉Elabscience）检测HA、LN、PIIINP和CIV的血清水平。

2.4. HE和天狼星红色染色

将组织切片固定在4%多聚甲醛中，用石蜡包埋，并使用标准技术进行切片。切片进行HE和天狼星红染色。根据改良的Scheuer纤维化评分系统，每个样本均由两名病理学家独立评估并评分，以进行盲法评估[14,15]. 纤维化分期评分分为五个阶段（0-4）：0:无，1:窦周纤维化3区；2:3区窦周纤维化加门脉纤维化；3：窦周纤维化和门脉纤维化，加上桥接性纤维化；肝硬化。

2.5. 细胞培养

大鼠HSC-T6细胞系是柯爱武博士（中国复旦大学中山医院肝癌研究所）赠送的礼物。细胞保存在含有10%胎牛血清（美国Hyclone）、青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 IU/ml）（美国Amresco）。细胞在37°C的5%CO2增湿环境中培养。

2.6. 细胞总cGMP的测定

收集HSC-T6细胞的上清液，并将其储存在−80°C下。根据制造商的建议，使用竞争性ELISA分析（美国开曼化学公司）测量cGMP的总水平。

2.7. PKG活性的测量

根据ELISA试剂盒（日本CycLex）的方案测量每个样品中PKG的活性，包括PKG-I和PKG-II，其中磷酸化抗体可以识别PKG底物上苏氨酸（Thr 68/119）残基的磷酸化。

2.8. 免疫荧光染色

如前所述进行免疫荧光染色分析[15]. 将细胞与针对α-SMA（ab5694）和结蛋白（ab15200）（1 : 50稀释度；Abcam，美国）。用PBS（5）清洗细胞三次 min），然后在黑暗中孵育1 室温下用Alexa Fluor 488和550结合的山羊抗鼠二级抗体（1 : 200稀释；ab150157和ab150083，美国Abcam）。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（Sigma-Aldrich，美国）。使用蔡司LSM 510 META共焦显微镜，使用20x/0.5获得图像 w和40x/1.2 w目标。

2.9. Western Blot分析

Western blot分析如我们之前的报告所述[16]. 本研究中使用的主要抗体如下：PPARγ（ab209350）（1 : 1,500),α-SMA（ab5694）、结蛋白（ab15200）、AKT（ab8805）、磷酸-AKT（ab81283）、PI3K p110β（ab151549），PDE5（ab14672）（1 : 1,000; 美国ABcam）和PI3K p110α(#4249) (1 : 1,200; Cell Signaling Technology，美国）。GAPDH的一级抗体稀释至1 : 1000–1500（美国圣克鲁斯）。次级HRP结合抗体在1 : 2,500. 使用ECL系统（Beyotime Biotechnology，中国）检测印迹。使用LI-COR Odyssey扫描仪（LICOR）分析印迹上的条带强度。

3.2. PPAR（购电协议）γ对抗缺氧应激引起的HSC活化

众所周知，HSC是诱导肝纤维化的重要效应器。以前，我们证明缺氧通过调节PPAR促进肝纤维化γ体外试验为了阐明HSC是否是这一过程的调节剂，HSC暴露于低氧应激下，不同时间氧浓度从21%降至7%。与对照组相比，PPARγ蛋白水平显著降低，呈时间依赖性，同时两个纤维化标志物的表达明显增加，α-SMA和结蛋白(图2（a）). 同时，根据我们的观察，缺氧暴露6小时后，趋势达到平稳。这些结果表明，缺氧应激的早期可能导致HSC活化。

在单独的窗口中打开

图2

PPAR（购电协议）γ抑制缺氧诱导的HSC激活。（a） HSC暴露于缺氧指定时间。PPAR的蛋白表达γ,α-western blotting检测SMA和结蛋白。HSC在存在或不存在PPAR的情况下暴露于缺氧6小时γ激动剂，罗格列酮（RSG，50 nM）。（b） PPAR（购电协议）γ,α-western blotting分析实验组HSC的SMA和结蛋白表达。（c）α-用免疫荧光共聚焦显微镜检测实验组HSC中SMA和结蛋白的表达。对于每个分析，n个= 3.^∗P（P）< 0.05,^∗∗P（P）< 0.01.

然后α-在存在或不存在PPAR的情况下，对缺氧暴露的HSC中的SMA和结蛋白进行分析γ激动剂，罗格列酮（RSG，50 nM），通过免疫印迹和免疫荧光法。正如预期的那样，单纯接触HSC的低氧暴露导致显著的PPARγ下调和α-SMA和结蛋白升高，而缺氧和RSG联合治疗可逆转这些影响(图2（b）)，表示PPARγ对抗缺氧应激引起的HSC活化。

3.3. PI3K/AKT信号参与低氧诱导PPARγ低表达

PI3K/AKT信号通路是细胞调节氧化应激效应并诱导HSC活化和增殖依赖于HIF-1的重要机制α对缺氧的反应。在这里，我们分析了PI3K/AKT信号是否与PPAR相关γ抑制低氧诱导的HSC激活。结果表明，当AKT磷酸化显著增强时，低氧诱导HSC激活(图3（c）). 用LY294002（20）抑制PI3K μM） 明确反对上述激活。同时，PPARγ表情也恢复了（图3（c）和3（d）). 类似地，用740 Y-P（25 μ在RSG（50）存在的情况下暴露于缺氧的HSC（g/ml） nM）显著降低PPARγ表达，同时α-SMA和desmin（图3（a）和3（b）). 这些结果表明PI3K/AKT信号传导阻断了PPAR的抑制作用γ低氧诱导HSC活化。

在单独的窗口中打开

图3

PI3K/AKT信号通路阻断PPAR的抑制作用γ低氧诱导的HSC激活。用740 Y-P（25）激活PI3K μ在有或无RSG（50）的情况下暴露于缺氧中的HSC（g/ml） nM）。（a） PPAR（购电协议）γ,α-western blotting分析实验组HSC的SMA和结蛋白表达。（b）α-用免疫荧光共聚焦显微镜检测实验组HSC SMA和结蛋白的表达。用LY294002（20）抑制PI3K μM） 暴露于缺氧的HSC。（c） 磷酸化AKT、总AKT、PPARγ,α-western blotting检测实验组HSC的SMA和结蛋白表达。（d）α-用免疫荧光共聚焦显微镜检测实验组HSC SMA和结蛋白的表达。对于每个分析，n个= 3.^∗P（P）< 0.05,^∗∗P（P）< 0.01.

这项工作得到了上海市科学技术委员会基金（批准号：16411972700）的支持。