LPS诱导的lncRNA Mirt2是炎症的负调节因子

巨噬细胞Mirt2由LPS诱导并被IL-4抑制

lncRNA-Mirt2对TLR4信号传导的反应通过qRT-PCR得到证实。LPS以时间和剂量依赖性的方式诱导培养的腹腔巨噬细胞中Mirt2的表达，在10 浓度为1时为h μg/mL（图1c、d). 用MTT法确认细胞活性。荧光原位杂交（FISH）显示Mirt2主要位于细胞质中（图第1页)提示Mirt2可能在细胞质中发挥其生物学功能。令人惊讶的是，Mirt2的增加并不是巨噬细胞或TLR4信号特异性的。如补充图所示^1a个LPS刺激还诱导气管上皮细胞、肝细胞和平滑肌细胞的Mirt2明显上调。除了通过LPS刺激对巨噬细胞TLR4信号作出反应外，Pam还诱导了Mirt2₂CSK公司₄（TLR2/6激动剂）和R848（TLR7/8激动剂）。相反，Pam_三CSK公司₄（TLR1/2激动剂）和Poly（I:C）是一种合成的双链RNA（TLR3激动剂），对Mirt2的表达没有影响（补充图^1亿). 巨噬细胞的免疫表型取决于细胞环境和各种激活分子的存在。促炎分子，如干扰素-γ（IFN-γ）和LPS，导致巨噬细胞（M1巨噬细胞）的经典激活。相反，在IL-4刺激下分化的选择性活化巨噬细胞（M2巨噬细胞）表现出不同的表型，可激发耐受性或T辅助因子2（Th2）免疫反应。值得注意的是，IL-4刺激导致Mirt2表达急剧下降，在2 h，最明显的时间为6 h（补充图^1c个). 这些发现导致了Mirt2是巨噬细胞极化调节器的假设。对小鼠组织分布的分析表明，Mirt2在巨噬细胞（腹腔和肺泡）中大量表达，其次是肾脏、肺和肝脏（图2a个). 与我们的体外实验结果一致，LPS给药诱导了不同小鼠组织中Mirt2水平的时间依赖性增加，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、脂肪、血管、腹腔巨噬细胞、肺泡巨噬细胞和血清（图2亿). 与证实脂肪组织和肺的共定位分析类似，LPS处理小鼠CD68阳性巨噬细胞内检测到Mirt2信号显著增加（图2厘米). 这些数据表明，Mirt2水平可以根据巨噬细胞极化状态动态变化，而巨噬细胞极化状态的两个极端是由LPS和IL-4诱导的。

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图2

在内毒素血症小鼠中诱导Mirt2表达。一Mirt2在C57BL/6小鼠中的表达和分布。b条Mirt2在LPS（25）激发内毒素血症小鼠不同组织中的表达 mg/kg）用于6和24 小时。c（c）正常或内毒素血症小鼠脂肪组织（上部）和肺（下部）中Mirt2的RNA FISH分析。为了进行共定位分析，对切片进行Mirt2（绿色）和CD68（红色，巨噬细胞标记物）的联合染色。DAPI用于细胞核染色（蓝色）。箭头表示Mirt2和CD68双阳性细胞。在每只小鼠的四个切片中对双阳性细胞进行计数并进行定量。数据表示为平均值 ± 扫描电镜（n = 6). *P（P） < 0.05与对照组双尾学生t吨两组测试

巨噬细胞中Mirt2表达的上游介质

LPS通过不同的途径激活巨噬细胞。使用选择性药物抑制剂（Bay-11-7082（NF-κB）、U0126（细胞外信号调节激酶，Erk）、SP600125（c-Jun N末端激酶，Jnk）、SB203580（p38）和PF-04965842（Janus激酶1，Jak1））评估抑制这些通路对Mirt2表达的功能后果。SB203580预处理完全消除了LPS诱导的巨噬细胞Mirt2上调。此外，选择性Jak1抑制剂PF-04965842对LPS诱导的Mirt2表达具有部分抑制作用（图3a年).

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图3

LPS通过p38-Stat1和IFN-Stat1信号上调巨噬细胞中的Mirt2。一用选择性药物抑制剂Bay-11-7082（NF-κB，10 μM），U0126（Erk，50 μM），SP600125（Jnk，50 μM），SB203580（第38、50页 μM）或PF-04965842（Jak1，50 nM），然后细胞被LPS激活（1 μg/mL，24 h） ●●●●。用qRT-PCR检测Mirt2的表达。b条将含有Mirt2启动子或其截断的荧光素酶报告子构建物与内部控制质粒pRL-TK共同转染到RAW264.7细胞中，然后进行LPS攻击（1 μg/mL，24 h） ●●●●。相对荧光素酶活性表示为对照组测定值的百分比。c（c）Stat1过度表达或Stat1敲低对培养的腹腔巨噬细胞中Mirt2表达的影响。d日Stat1 siRNA的敲除效率。e（电子）含有Mirt2启动子（-389bp~+163）的荧光素酶报告子结构 bp）或其突变体（用于Stat1结合位点）与内部控制质粒pRL-TK共同转染到RAW264.7细胞中，然后进行LPS攻击（1 μg/mL，24 h） ●●●●。左侧面板显示了相对荧光素酶活性，以对照组测定值的百分比表示。右侧面板显示了两个独立的Stat1结合位点的突变。（f）p38过度表达对用干扰siRNA或si-Stat1预处理的培养腹腔巨噬细胞中Mirt2表达的影响。克IFN-β对用scramble siRNA或si-Stat1预处理的培养的腹膜巨噬细胞中Mirt2表达的影响。小时外源性IFN-β对p38抑制剂抑制的Mirt2表达的影响。我用IFN-α/β抗体预处理培养的腹腔巨噬细胞，然后用LPS（1）激活细胞 μg/mL，24 h） ●●●●。通过qRT-PCR检测Mirt2的表达。j个经TLR配体处理的培养腹腔巨噬细胞中IFN-β的表达。k个TLR配体诱导的Stat1磷酸化。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SEM*P（P） < 0.05之间。ns无显著性。双尾学生的t吨-两组检验和多组单因素方差分析

为了进一步探讨LPS激活的巨噬细胞Mirt2升高的机制 建立了bp Mirt2启动子荧光素酶报告子构建及其截短片段，并将其转染到培养的RAW264.7细胞中。LPS处理显著增加了所有截短结构体的荧光素酶活性，包括最短结构体，该结构体预计包括潜在的LPS反应元件（图3亿). 我们进一步对该序列（−389）进行了电子分析 bp至+163 bp）并发现两个分离的信号转导子和转录激活子1（Stat1）结合位点。Stat1的沉默完全消除了LPS诱导的巨噬细胞中Mirt2的表达，而Stat1的过度表达则有相反的作用（图3立方厘米). Western blot显示了Stat1 siRNA的敲除效率（图三维). 与这些结果一致，这两个位点的突变部分降低了LPS诱导的荧光素酶活性，并且这两个位置的突变完全逆转了这些影响（图第三版). 这些结果表明，−389 bp至+163 bp元件参与LPS依赖性Mirt2上调，该反应由转录因子Stat1介导。我们之前的研究表明，SB203580对p38通路的抑制可诱导Mirt2表达减少，以应对LPS。一贯地，无论是在静息状态下还是在LPS激活后，增强p38表达都会增加巨噬细胞中的Mirt2水平，而这些影响可以通过Stat1的敲除而完全消除（图第3页). 诱导p65 ERK1、ERK2、JNK1和JNK2的表达对Mirt2的表达没有影响（补充图^1天). 这些结果表明，LPS-p38-Stat1通路负责LPS诱导巨噬细胞中Mirt2的上调。除p38通路外，LPS诱导的自分泌/旁分泌IFN-α/β也介导Stat1的激活，而这不能被p38抑制剂SB203580所抑制。如我们的研究所示，IFN-β刺激不会影响基础Mirt2水平，但会进一步增加其在LPS激活的巨噬细胞中的表达，这些作用可以通过Stat1沉默完全消除（图3克). 先前的研究表明，p38参与巨噬细胞中IFN-β的诱导^18,19,]然而，补充外源性IFN-β并没有缓解p38抑制剂对Mirt2表达的抑制作用（图3小时). 因此，Mirt2表达的减少不是由于p38抑制剂治疗后IFN-β的减少。此外，靶向IFN-α/β的中和抗体部分抑制了LPS诱导的Mirt2上调（图第3页). 结果表明，LPS-p38-Stat1对Mirt2的表达是必不可少的，而LPS-IFN-α/β-Stat1增强了这些作用。因此，补充外源性干扰素-β并不能缓解p38抑制剂对Mirt2表达的抑制作用，因为LPS-p38-Stat1通路受到抑制。

为了进一步探讨其机制，我们评估了在TLR刺激下IFN-β的诱导和Stat1的激活。我们的研究表明，TLR2（Pam）的参与_三CSK公司₄和Pam₂CSK公司₄)TLR4（LPS）和TLR7/8（R848）导致快速磷酸化（30 min），而TLR4（LPS）、TLR3（Poly（I:C））和TLR7/8（R848）诱导Stat1在酪氨酸701（T-701）磷酸化，尽管这种反应被延迟（4 h） 与S-727磷酸化相比（图3公里). 先前的研究表明TLR诱导的Stat1丝氨酸磷酸化依赖于p38；然而，Stat1的酪氨酸磷酸化通过内源性I型干扰素的产生间接介导，尤其是干扰素-β²⁰一直以来，我们发现TLR4、TLR3或TLR7/8刺激导致干扰素β的强烈诱导（图第3节). 我们之前的结果表明，只有TLR2、TLR4和TLR7/8刺激才能诱导Mirt2（补充图^1亿)这表明p38-Stat1（S-727）对诱导是必不可少的，而IFNα/β-Stat1则加强了这些作用。补充图中描述了可能的机制⁶.

此外，LPS对Mirt2的诱导被Myd88或TRIF的敲除部分抑制，而这两种蛋白的敲除完全消除了LPS的作用（补充图^第1页). 通过Western blot评估Myd88和TRIF siRNA的敲除效率（图第1页). TRIF信号在I型干扰素表达中更为显著，而p38激活通过Myd88或TRIF途径独立发生^21,22TRIF的敲除取消了1型干扰素的诱导，但对p38磷酸化没有影响。此外，敲除Myd88并没有完全抑制p38的激活。我们认为，敲除这两种蛋白可以完全消除LPS对Mirt2的诱导作用。

如前所述，IL-4刺激导致Mirt2表达显著降低（补充图^1c个). Jak3是Jak家族激酶的一员，被确定为髓系细胞中与IL-4受体偶联的主要效应分子²³Jak3抑制剂WHI-P154的预处理逆转了IL-4的作用，而PI3K抑制剂沃特曼和Jak2抑制剂TYRPhostin没有作用（补充图。1g–i）。使用一系列包含Mirt2缺失的5′-侧翼区域的荧光素酶报告子构建物，我们将序列-2324bp至-1754bp鉴定为IL-4反应元件（补充图^1日). Stat6和PPARγ的结合位点均包含在该序列中，它们是IL-4-Jak3的关键下游信号分子。然而，只有Stat6沉默恢复了被IL-4抑制的Mirt2的表达（补充图^1公里). Western blot显示了Stat6和PPARγsiRNA的敲除效率（补充图^1升). 一直以来，Stat6结合位点的突变逆转了IL-4刺激减弱的荧光素酶活性，而PPARγ结合位点的变异没有影响（补充图^100万). 这些结果表明，Stat6是IL-4的一个关键下游转录因子，负调控巨噬细胞中Mirt2的表达。

Mirt2调节巨噬细胞极化

为了确定Mirt2在LPS介导的巨噬细胞炎症和免疫反应中的功能作用，通过腺病毒介导的基因修饰增强或沉默了Mirt2的表达。增强或沉默Mirt2的表达不会改变炎症因子的基础水平，如TNF、IL-1β、IL-6和IL-12。然而，在LPS激活的巨噬细胞中，Mirt2的异位表达在4和20时抑制了所有这些炎症因子的异常激活 h、 Mirt2沉默导致20岁时TNF、IL-1β、IL-6和IL-12的表达进一步增加 h；在后一个时间点，对照组中这些细胞因子的水平迅速下降（图4a–d). 相反，脂多糖诱导的I型干扰素和干扰素依赖基因的表达，如干扰素β和干扰物刺激基因15（isg15），不受Mirt2增强或沉默的影响（图4e、f).

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图4

Mirt2抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。一–（f）通过qRT-PCR测定，Mirt2过表达或Mirt2敲低对LPS诱导的培养腹膜巨噬细胞中炎症因子表达的影响。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SEM*P（P） < 0.05 vs.Ad-EV或Ad-shNC组。克Western blot检测到Mirt2过度表达或Mirt2敲除对LPS诱导培养的腹腔巨噬细胞NF-κB和MAPK通路激活的影响。小时免疫荧光检测检测Mirt2对LPS处理巨噬细胞p65核移位的影响。我面板中p65核移位的量化小时数据代表平均值 ± 三个独立实验的SEM*P（P） < 0.05 vs.Ad-EV。两组的双尾学生t检验和多组的单向方差分析

由于NF-κB和MAPK通路明确参与LPS活化巨噬细胞的炎症反应，我们检测了Mirt2与这两条通路的关键信号蛋白磷酸化之间的相关性。如图所示4克巨噬细胞中p65、Jnk、Erk1/2和p38的磷酸化水平在0.5和2时达到峰值 LPS治疗后h，在6和10时迅速降至基线水平 h.令人惊讶的是，外源性Mirt2降低了p65、Jnk和p38的磷酸化水平，沉默Mirt2导致信号通路持续激活达10 h.免疫荧光分析一致表明，Mirt2抑制了培养巨噬细胞中LPS诱导的p65核移位（图4小时，i). 总之，这些数据表明，Mirt2作为负调控因子抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活，从而抑制LPS激活的巨噬细胞中炎症基因的上调。

与LPS相比，IL-4促进交替激活巨噬细胞的分化，降低了Mirt2水平，如前所示（补充图^1c个). 我们探讨了Mirt2是否参与了由IL-4诱导的经典M2标记物和细胞因子的表达。在异位表达Mirt2的巨噬细胞中，IL-4刺激导致Arg1、CD206、Fizz1、Ym1和CCL24水平更快且显著增加，Mirt2沉默反映了Mirt2过度表达的影响（补充图^2a–小时). 然而，Stat6磷酸化和PPARγ表达（肯定介导IL-4诱导的巨噬细胞M2极化）不受Mirt2的影响（补充图^第2页). 用qRT-PCR检测腺病毒感染效率（补充图^2日). 这些数据表明，除了参与LPS诱导的炎症反应的调节外，Mirt2还通过一种可能独立于Stat6和PPARγ途径的机制影响IL-4诱导巨噬细胞M2极化。

Mirt2抑制TRAF6齐聚和自泛素化

接下来，我们使用生物素化Mirt2进行下拉分析，然后使用质谱（MS）在巨噬细胞中搜索潜在的Mirt2相互作用蛋白。TRAF6是一种关键的信号蛋白，在典型NF-κB和MAPK通路的激活中具有关键功能，被鉴定为Mirt2相关蛋白（图第5页). 独立免疫印迹证实了这一发现（图5亿)RNA免疫沉淀（RIP）分析进一步验证了这种相互作用的特异性（图5厘米). 此外，共聚焦显微镜下的Mirt2和TRAF6免疫染色显示，Mirt2与TRAF6在LPS激活的培养巨噬细胞的细胞质中共定位（图5天). 我们还观察到非刺激巨噬细胞中Mirt2和TRAF6的共定位（图5天)表明内源性相互作用不依赖于刺激。然而，由于基础Mirt2水平相对较低，TRAF6在刺激后被激活，因此Mirt2在静息细胞中的作用可能有限，尽管这种可能性需要进一步研究。用Mirt2截短片段进行RNA下拉分析表明，只有全长Mirt2与TRAF6结合，而其他截短片段完全失去了其结合能力（图第五版). TRAF6由一个氨基末端RING结构域组成，其后是几个锌指基序、一个中心螺旋区和一个高度保守的羧基末端结构域，称为TRAF-C结构域²⁴我们使用截短的TRAF6进行了蛋白质结构域定位实验，这表明TRAF6的RING结构域和锌指基序负责与Mirt2的相互作用（图第5页).

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图5

Mirt2抑制TRAF6齐聚和自泛素化。一巨噬细胞中与生物素化lncRNA-Matr2结合的蛋白质的银染SDS-PAGE凝胶分析。通过质谱分析突出显示的区域，确定TRAF6是Mirt2特有的蛋白质。b条使用抗TRAF6抗体对与生物素化Mirt2结合的巨噬细胞中的蛋白质进行免疫印迹分析。c（c）使用抗TRAF6抗体进行RNA免疫沉淀（RIP）分析以确定巨噬细胞中Mirt2的恢复。IgG作为对照。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SEM*P（P） < 0.05 vs.IgG组。d日RNA FISH技术和免疫荧光分析确定巨噬细胞中Mirt2（绿色）和TRAF6（红色）的共同定位。DAPI用于细胞核染色（蓝色）。这些图像对应于Z堆栈的一个薄片，实验重复了三次。e（电子）RNA下拉分析用于确定TRAF6与Mirt2全长或截断的相互作用。（f）将myc标记的TRAF6（野生型或结构域截断突变体）构建物转染到HEK293T细胞中，通过生物素化Mirt2转录物将其拉下，并用myc抗体进行Western blot检测。底部：TRAF6的域结构。克免疫沉淀HA-TRAF6（myc-TRAF6），然后在表达两种TRAF6结构的HEK293T细胞中进行myc-TRAF 6（HA-TRAF 6）的免疫印迹分析，以检测是否存在Mirt2时TRAF6的寡聚。小时转染表达myc标记TRAF6和HA标记泛素的HEK293T细胞中TRAF6泛素化的免疫印迹分析。左图：TRAF6的全泛素化；中间面板：TRAF6的K48连锁和K63连锁泛素化；右面板：不同浓度的Mirt2对TRAF6泛素化的影响。我巨噬细胞内源性TRAF6 K63相关泛素化的免疫印迹分析。j个免疫沉淀HA-Ubc13（myc-TRAF6），然后免疫印迹分析表达这两种结构的HEK293T细胞中的myc-TRAF13（HA-Ubc3），以检测TRAF6和Ubc13的相互作用。k个使用TRAF6抗体对巨噬细胞中Ubc13免疫沉淀的含量进行免疫印迹分析。我Western blot检测Mirt2基因敲除对转染si-TRAF6或干扰siRNA的巨噬细胞p65和Jnk磷酸化的影响

一旦TLR4信号被激活，TRAF6被招募到受体复合体，其中它协助TLR4介导下游信号，包括NF-κB和MAPK。环结构域和锌指基序介导的TRAF6的寡聚和自泛素化对信号转导至关重要²⁵我们确定Mirt2与TRAF6在TRAF-N结构域的相互作用是否影响其寡聚和泛素化。我们的Co-IP分析表明，外源Mirt2以剂量依赖的方式显著抑制TRAF6的齐聚（图5克). 为了确定Mirt2对TRAF6泛素化的影响，我们转染HEK293T细胞，在Ad-EV或Ad-Mirt2存在下表达Myc-tagged TRAF6和HA-taged泛素。然后对细胞进行裂解，并用抗Myc抗体进行IP处理，用抗HA抗体进行IB处理。结果表明，Mirt2的存在显著影响TRAF6上泛素的数量（图5小时，左侧面板）。在进一步研究确定TRAF6上泛素的类型时，HEK293T细胞转染了表达泛素突变形式的质粒，该突变形式的泛素通过K48或K63连接特异性泛素化。Mirt2的存在以剂量依赖的方式导致K63连接泛素的减少，但在K48连接泛素中未发现显著变化（图5小时中间和右侧面板）。这一结果表明，Mirt2降低了激活的K63连接泛素化的TRAF6，但保留了降解的K48连接泛素不变。这一发现在LPS处理的腹腔巨噬细胞中得到了进一步证实，其中TRAF6的K63泛素化在30时显著升高 最小值，降至基线水平6 h.Mirt2消除了LPS对TRAF6 K63泛素化的诱导，并且Mirt2的敲低导致即使在6 LPS处理后h（图第5页). 相反，TRAF2和TRAF3的自泛素化不受Mirt2的影响（补充图^3a–c). TRAF6介导的Lys63连锁多泛素化需要RING结构域的完整性及其与Ubc13和Uev1A的异二聚体E2复合物相互作用的能力。虽然Ubc13介导与E3的直接相互作用，但Uev1A提供了连锁特异性²⁶如预期，Mirt2还抑制了表达外源TRAF6和Ubc13的HEK293T细胞中TRAF6与Ubc13之间的相互作用（图5焦耳)或LPS激活的巨噬细胞（图5公里). 为了验证TRAF6在Mirt2介导的炎症调节中的关键作用，我们敲除了巨噬细胞中的TRAF6，发现导致NF-κB和MAPK通路在LPS刺激中持续激活的Mirt2沉默作用被完全消除（图5升). 此外，LPS-TLR4信号级联通过TRAF6的下游信号蛋白受到影响，如p-TAK1、p-MKK4、p-MKK7和p-IKKα/β，这些蛋白受到Mirt2增强或沉默的影响，而TRAF6上游信号分子，如TLR4、CD14、Myd88和p-IRAK4，提醒保持不变（补充图^3d–g). 由于我们未能检测到TAK1和Mirt2之间的相互作用（补充图^3小时)，我们认为TAK1磷酸化减少是由于Mirt2抑制TRAF6泛素化所致。除了Toll样受体家族外，TRAF6也是一个重要的对接分子，它介导巨噬细胞中白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子（TNF）受体家族（即NF-κB受体激活剂，RANK）启动的信号事件^25,27如补充图所示^第3页Mirt2显著抑制了由IL-1β或NF-κB配体受体激活剂（RANKL，也称为OPGL或ODF）激活的p65的磷酸化。然而，Mirt2对由TRAF2介导的TNF诱导的p65活化没有影响。这些结果确定TRAF6是Mirt2介导的炎症调节的关键点。因此，Mirt2与TRAF6的RING结构域和锌指基序相互作用，并破坏其寡聚和与Ubc13的关联，从而抑制TRAF6自身泛素化和相关炎症反应。TRAF6泛素化减少似乎不是由于去泛素化酶的功能，因为A20的表达受到抑制，并且在Mirt2过度表达时CYLD提醒保持不变（补充图^3j和k).

Mirt2可预防LPS诱导的内毒素血症

脓毒症、感染性休克和内毒素血症是全身炎症状态，影响身体大多数器官，包括肺、肝、心脏和白色脂肪组织²⁸我们研究了Mirt2对LPS攻击诱导的内毒素血症小鼠的影响。通过尾静脉给药Mirt2重组腺病毒导致小鼠各种组织中Mirt2水平显著增加，尤其是肝脏，其次是脂肪、肺、心脏和腹腔巨噬细胞（图第6页). 72岁时 LPS注射后h，Ad-EV处理的小鼠仅存活12.5%，而Ad-Mirt2给药显示出显著的保护作用，72岁时存活50% h在所有小鼠中（图第6页). 此外，外源性Mirt2导致促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF的血浆浓度在6 LPS给药后h（图第6页c). 内毒素血症与器官损伤和功能衰竭有关。LPS攻击小鼠的肺、肝、心脏和脂肪组织出现不同程度的急性炎症。肺组织病理学检查表明，LPS治疗小鼠的肺部炎症、出血和肺泡间隔增厚加剧，而Ad-Mirt2治疗小鼠的肺损伤较少，肺损伤评分较低，炎症细胞浸润减少（图第6天，第5天). Western blot分析表明，与Ad-EV治疗组的磷酸化水平相比，Ad-Mirt2预处理显著抑制了LPS诱导的肺组织p65和Jnk磷酸化（图6f，克).

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图6

Mirt2可减轻LPS诱导的内毒素血症。腹腔注射LPS（25 mg/kg），对照动物服用等量的生理盐水。腺病毒（Ad-Mirt2或Ad-EV）在LPS攻击前3天通过尾罩注射进入小鼠体内。一腺病毒感染效率为72 腺病毒给药后h。b条内毒素血症小鼠存活曲线（n = 12).c（c）LPS攻击小鼠6周后血清中细胞因子（IL-1-β、IL-6和TNF）的水平 h.数据表示为平均值 ± 扫描电镜（n = 8). *P（P） < 0.05 vs.Ad-EV组。d日Ad-EV或Ad-Mirt2治疗小鼠的肺组织病理学24 LPS激发后h。上面板：苏木精伊红染色；中幅：巨噬细胞标志物F4/80免疫组化染色；下面板：中性粒细胞标记物Ly6G的免疫组织化学染色。e（电子）面板肺损伤的定量分析d日左侧面板：肺损伤评分；中间面板：F4/80阳性细胞定量分析；右侧面板：Ly6G阳性细胞的定量分析。数据表示为平均值 ± 扫描电镜（n = 8). *P（P） < 0.05 vs.Ad-EV组。（f）内毒素血症小鼠肺p65和Jnk磷酸化的Western blot分析。克面板中带密度的量化（f）数据表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 5). *P（P） < 0.05 vs.Ad-EV组。小时Ad-EV或Ad-Mirt2治疗小鼠的肝脏组织病理学24 LPS激发后h。上面板：苏木精伊红染色；中幅：巨噬细胞标志物F4/80免疫组化染色；下图：油红色O染色。我h组肝损伤的定量分析。左组：肝损伤评分；中间面板：F4/80阳性细胞定量分析；右侧面板：甘油三酯含量的测定。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 8). *P（P） < 0.05 vs.Ad-EV组。j个内毒素血症小鼠肝脏p65和Jnk磷酸化的Western blot分析。k个面板中带密度的量化j个数据表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 5). *P（P） < 0.05 vs.Ad-EV组。双尾学生的t吨-两组测试

同样，在Ad-Mirt2治疗的小鼠中，LPS诱导的肝损伤和炎症信号通路的激活也得到缓解。相反，如油红O染色和肝甘油三酯水平测定所示，脂质含量不受影响（图6小时–公里). Mirt2对内毒素血症小鼠脂肪组织和心脏炎症反应的影响不如对肺和肝脏的影响显著。外源性Mirt2不抑制脂肪组织和心脏中巨噬细胞浸润和p65通路的激活；然而，在用Ad-Mirt2处理的小鼠的脂肪组织中观察到Jnk磷酸化减弱（补充图^4a–小时). 综上所述，这些结果表明，Mirt2能有效缓解LPS诱导的内毒素血症和器官功能障碍，尤其是在肺和肝脏。此外，在接受腺病毒的小鼠体外培养巨噬细胞中证实了Mirt2的抗炎作用。与对照组巨噬细胞的表达相比，经Ad-Mirt2处理的小鼠巨噬细胞中LPS诱导的炎性因子表达受到显著抑制（补充图^4i–k).

Mirt2在各种细胞类型中具有抗炎作用

我们之前证明，Mirt2通过抑制TRAF6寡聚和自泛素化减轻巨噬细胞的炎症反应。然而，这些效应是巨噬细胞特异性的还是在其他细胞类型中普遍存在尚不完全清楚。为了阐明这一点，对代表内毒素血症期间受损的四个重要器官的原代细胞（气管上皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、心肌细胞和心脏成纤维细胞）进行培养，并用LPS进行攻击。Ad-Mirt2预处理显著抑制LPS诱导的气管上皮细胞中IL-6、IL-1β和IL-23α的表达（图第7页). 与我们在巨噬细胞中的观察结果一致，外源性Mirt2消除了p65和Jnk磷酸化以及TRAF6的K63泛素化（图7b–d日). 同样，在LPS处理的原代肝细胞中，炎症因子IL-6、MCP1和CXCL9的异常激活被Mirt2过度表达所抑制（图第7页). 然而，Mirt2对脂多糖诱导脂肪细胞中炎症因子的表达以及NF-κB和MAPK通路的激活没有明显影响（补充图^5a–c级)，心肌细胞（补充图^5天)或心脏成纤维细胞（补充图^第五版). 这些结果表明，Mirt2对炎症调节的影响不是巨噬细胞特异性的，至少在气管上皮细胞和肝细胞中也有发现。这一发现可以部分解释为什么Ad-Mirt2在内毒素血症小鼠的肺和肝中发挥更显著的保护作用。令人惊讶的是，携带鼠源性mirt2基因的腺病毒也对一些来源于人类的细胞类型产生了显著的抗炎作用，例如单核细胞来源的巨噬细胞（补充图^第5页)和肝细胞（补充图^5克).

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图7

Mirt2对气管上皮细胞和肝细胞具有抗炎作用。一通过qRT-PCR测定Mirt2过度表达对气管上皮细胞中炎症因子表达的影响。b条Western blot测定Mirt2过度表达对气管上皮细胞p65和Jnk磷酸化的影响。c（c）面板中带密度的量化b条.d日用TRAF6抗体进行免疫沉淀后，对LPS处理过的Mirt2过度表达气管上皮细胞中内源性TRAF6的K63连锁泛素化进行免疫印迹分析。e（电子）通过qRT-PCR测定Mirt2过度表达对肝细胞炎症因子表达的影响。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SEM*P（P） < 0.05 vs.Ad-EV组。双尾学生的t吨-两组测试

RNA提取和qRT-PCR

使用TRIzol试剂（D9108A，Takara Bio）从细胞或组织中提取总RNA。使用RNA PCR试剂盒（RR036A，Takara Bio）逆转录RNA。根据制造商的说明，使用ABI PRISM 7900序列检测系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统）进行定量聚合酶链反应（PCR）扩增。使用比较Ct法公式2计算相对基因表达（Mirt2和其他宿主炎症基因，归一化为内源性控制基因β-actin）^-ΔΔCt实时PCR引物序列见补充表¹.

蛋白质印迹

在指定的时间采集细胞或组织，并在添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich）的冰镇悬浮缓冲液中均质。使用BCA蛋白质分析试剂盒（马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Scientific）测定蛋白质浓度。用SDS聚丙烯酰胺凝胶分馏等量的蛋白质，然后用以下主要抗体进行免疫印迹：NF-κB通路取样器试剂盒（1:1000，9936，CST，MA稀释），磷酸-MAPK家族抗体取样器药盒（1:10009910，CST和MA稀释）、MAPK家族抗体采样器试剂箱（1:100099626，CST、MA稀释），磷酸化-Stat6抗体（兔多克隆，1:1000稀释，ab28829，Abcam），Stat6抗体，CD14抗体（兔多克隆，1:1000稀释，ab203294，Abcam）、Myd88抗体（兔多克隆，1:100稀释，ab2064，Abcam）、PPARγ抗体（兔单克隆（C26H12），1:1000，sc-7273，Santa Cruz Biotechnology）。然后将膜与过氧化物酶结合的二级抗体孵育，并使用Bio-Rad（Hercules，CA）成像系统检测特定条带。补充图中提供了原始印迹⁸.

RNA FISH和蛋白质免疫荧光

将生长在玻璃盖玻片或组织切片上的细胞固定在4%多聚甲醛中30 最小值，并用0.1%Triton X-100渗透。然后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞三次，并用预杂交缓冲液（2 × 盐水柠檬酸钠、10%甲酰胺）。将Mirt2（Exiqon）的FISH（荧光原位杂交）探针重新悬浮在杂交缓冲液（2 × 生理盐水柠檬酸钠、10%甲酰胺、10%右旋糖酐硫酸盐）至最终浓度250 nM每个探头组。杂交在37℃的加湿室中进行 16°C h.用Mirt2探针孵育后，用PBS清洗细胞三次，并在37℃下用TRAF6抗体处理细胞 °C；2 h后，用PBS清洗细胞三次，并用荧光标记的二级抗体处理细胞1 37小时 °C。我们继续进行了几轮清洗（包括可选的4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色步骤），最后使用防褪色的安装介质将盖玻片安装到显微镜载玻片上。用于成像的抗体和次级抗体的信息如下：TRAF6抗体（兔多克隆，1:200稀释，ab94720，Abcam），p65抗体（兔单克隆（E379），1:100稀释，ab32536，Abcam），CD68抗体（小鼠单克隆（C68/684），1:200，ab201340，Abca姆），iNOS抗体（兔单克隆({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“EPR16635”，“term_id”：“523382660”，“term_text”：“ERP16635”}}EPR16635型)，1:100稀释，ab178945，Abcam），精氨酸酶抗体（兔多克隆，1:1000稀释，ab91279，Abcam），山羊抗鼠IgG（ab150115，Abcam]，山羊抗兔IgG。

RNA下拉和质谱

使用生物素RNA标记混合物和T7 RNA聚合酶（Ambion）对生物素标记的RNA进行体外转录，并使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN）对DNA进行柱消化纯化。生物素化Mirt2、反义Mirt2或截短的Mirt2与细胞裂解物（含有Rnasin）在4 °C。相互作用的配合物用链霉亲和素珠纯化3 h，并通过银染色（皮尔斯银染色试剂盒，Thermo Scientific）进行质谱观察，或使用TRAF6或TAK1的特异性抗体进行免疫印迹。对于质谱，提取了实验通道中的特定波段（也提取了控制通道中的相应区域）以进行进一步分析。

rna免疫沉淀

用0.3%甲醛处理细胞10次 37时最小值 °C。总计1.25 将溶解在PBS中的M甘氨酸添加到0.125的浓度 M、 样品孵育5次 在室温下最小。然后在PBS中清洗细胞两次并造粒。将颗粒重新悬浮在RIPA缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，150 mM氯化钠，1 mM EDTA、0.1%十二烷基硫酸钠、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.5 mM DTT和1 mM PMSF/鸡尾酒）⁴¹，在冰上孵育，经常出现漩涡30 最少添加TRAF6抗体或IgG，并在4 °C。用蛋白质G Dynabeads回收RNA/蛋白质复合物，并用RIPA缓冲液洗涤数次。用Trizol回收RNA并进行RT-PCR分析。

质粒构建和报告分析

从ORIGENE（MR208489）中获得野生型TRAF6质粒，并通过PCR制备TRAF6的截短结构（1–259aa、1–357aa、260–530aa、358–530ae、1-149aa、150–259ae），克隆到带有C末端Myc标记的pCMV6-入口哺乳动物载体。对于报告基因测定，从小鼠基因组DNA中PCR扩增具有不同长度的Mirt2启动子，并使用一步克隆试剂盒（C112-02，Vazyme Biotech Ltd.，Nanjing，China）将其克隆到pGL3碱性载体（Promega，Madison，WI）中。荧光素酶报告载体与内部控制质粒pRL-TK（Renilla Luciferase reporter plasma，Promega）共转染到RAW264.7细胞中，然后用LPS或IL-4刺激。然后，根据制造商的说明，采集细胞，进行裂解，并使用双荧光素酶报告试剂盒（Promega）测定荧光素素酶活性。

泛素化分析

表达构建的野生型UB-HA、K48-UB-HA（除赖氨酸48突变为精氨酸外的所有赖氨酸）和K63-UB-HA。为了通过免疫沉淀进行体内泛素化分析，细胞在SDS裂解缓冲液（20 mM Tris–HCl，pH 7.4，150 mM氯化钠，1 mM EDTA，1%十二烷基硫酸钠），含蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（04693132001，罗氏），加热变性5 min.用RIPA缓冲液将裂解产物稀释至0.1%十二烷基硫酸钠，并在13200下离心 转速为4转/分 10°C min。将上清液与所示抗体和蛋白A/G-Sepharose（GE healthcare）进行免疫沉淀3 h、 在4 °C。用RIPA缓冲液洗涤三次后，用SDS-PAGE分离结合蛋白，并用泛素特异性抗体进行Western blot分析。补充图中提供了未截取的全长吸墨纸⁸.

重组腺病毒的产生

携带Mirt2（Ad-Mirt2）整个编码序列的复制缺陷型重组腺病毒是用腺病毒表达载体试剂盒（日本Kusatsu Takara Bio Inc.）构建的。使用仅含腺病毒的绿色荧光蛋白（GFP）作为阴性对照（Ad-EV）。为了产生针对Mirt2的表达shRNA的腺病毒（Ad-sh-Mirt2），设计了3种用于小鼠Mirt2的siRNA，并选择具有最佳敲除效率的siRNA来产生shRNA，然后重组到腺病毒载体中。目标序列如下：CCTCCTCGACGGATTTCAA。阴性对照腺病毒旨在表达非靶向性“通用控制”shRNA（Ad-shNC）。根据制造商的说明（Takara Bio）对重组腺病毒进行扩增和纯化。

老鼠

年龄为8-12周的雄性C57BL/6小鼠在我们的动物设施的常规饲养条件下繁殖和饲养，所有动物实验方案均经中国华中科技大学联合医院伦理委员会批准，并按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行。腺病毒（Ad-Mirt2或Ad-EV，5 × 10⁹ pfu/小鼠）于内毒素血症模型建立前3天通过尾罩注射进入小鼠体内。对于LPS诱导的内毒素血症模型，小鼠腹腔注射LPS(大肠杆菌0111:B4，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）剂量为25 mg/kg。对照动物服用等量的生理盐水。他们的存活率一直被监测和记录到72 h.在30时处死所有小鼠 检测炎症途径激活的min，在6 h用于测定血浆中的炎症因子，24小时 h用于组织学评估。根据预先确定的样本采集期间可见异常组织结构或其他健康问题（包括战斗创伤）的标准，动物数据被排除在实验之外。

酶联免疫吸附试验

根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒计算动物血浆中TNF、IL-6和IL-1β的浓度。ELISA试剂盒为：TNF（MTA00B，研发系统）、IL-6（M6000B，开发系统）、IL-1β（MLB00C，研发系统。

细胞培养

从C57BL/6小鼠中分离出腹腔巨噬细胞⁴²简单地说，首先用无菌氯化钠（0.9%）冲洗腹腔，然后收集、汇集和离心洗液。将细胞颗粒悬浮在补充有10%胎牛血清（Gibco）的RPMI1640培养基（Gibco）中。巨噬细胞可以粘附在培养皿中2 h.通过清洗去除非粘附细胞，并将粘附细胞保持24 h在10%含血清培养基中进行进一步研究。如前所述，制备了原代气管上皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、心肌细胞和心脏成纤维细胞^43–46从ATCC中获得HEK293T细胞（CRL-11268）和RAW264.7细胞（TIB-71），并在添加10%胎牛血清的完整DMEM培养基中培养，以进行进一步研究。所有细胞系均无支原体污染（由供应商使用Lonza的MycoAlert试剂盒进行测试）。根据供应商进行的短串联重复序列（STR）分析，在常见错误识别的细胞系（ICLAC和NCBI生物样本）数据库中未发现本研究中使用的细胞系。

统计分析

GraphPad Prism软件（加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad-software Inc.）用于统计分析。用Image J软件定量western blot图像中的条带强度。值表示为平均值 ± 至少三个独立实验的SEM。学生的t吨采用检验法评估两组间差异的统计学意义。对于多个组，采用Bonferroni检验通过单因素方差分析评估显著性。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。对于动物存活分析，采用Kaplan–Meier方法生成图形，并使用对数秩分析分析存活曲线。尽可能采用随机和盲法策略。动物队列大小是在先前类似研究的基础上确定的。

本研究得到了国家自然科学基金（No.81570405）和国家重点研发计划（No.2016YFA0101101）的资助。